β-catenin在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過程中的調(diào)控作用.pdf

1、牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)具有克隆、自我復(fù)制和多向分化的能力，因其經(jīng)過誘導(dǎo)后可分化為成骨細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，在牙組織工程中有極高的應(yīng)用潛力。然而hPDLSCs的分化機(jī)制仍不十分清楚，這極大的限制了其組織工程走向臨床應(yīng)用。已有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)途徑參與干細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化并抑制成骨細(xì)胞發(fā)生礦化[1][38]，，Wnt/β-catenin途徑中關(guān)鍵蛋白因子β-catenin的積累

2、和穩(wěn)定表達(dá)提示該通路被激活，β-catenin與細(xì)胞增殖和分化能力密切相關(guān)[19]。本課題研究小組前期證實(shí)動(dòng)態(tài)張應(yīng)力促進(jìn)hPDLSCs成骨分化，然而Wnt/β-catenin是否參與了hPDLSCs應(yīng)力下成骨仍有待進(jìn)一步研究。本研究首先探明hPDLSCs在應(yīng)力成骨時(shí)Wnt/β-catenin通路被激活;再使用小分子激動(dòng)劑和抑制劑干預(yù)Wnt/β-catenin通路活化水平，觀察對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨分化的影響，借以探討Wnt/β-cat

3、enin信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的調(diào)控作用，以期從分子水平探討矯治性牙位移動(dòng)的發(fā)生機(jī)制并為hPDLSCs組織工程提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：探究Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的調(diào)控作用，探索hPDLSCs的應(yīng)力成骨分化的分子機(jī)制。
　　方法：1.分離獲得hPDLSCs的原代細(xì)胞，篩選以β-catenin為靶點(diǎn)的適宜濃度的激動(dòng)劑WAY262611和抑制劑XAV939作用于第3-6代hPDLSC

4、s，并計(jì)算藥物的半最大效應(yīng)濃度(EC50)，在該濃度下培養(yǎng)1-4天后用CCK-8法檢測(cè)hPDLSCs增殖活力。另外通過免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)激動(dòng)劑和抑制劑作用下hPDLSCs的β-catenin蛋白表達(dá)。
　　2.利用FX-4000T加載系統(tǒng)促進(jìn)hPDLSCs應(yīng)力成骨，并測(cè)定成骨標(biāo)志物BMP2、Runx2、ALP的表達(dá)，同時(shí)利用Western blot對(duì)hPDLSCs在應(yīng)力成骨時(shí)β-catenin蛋白的表達(dá)變化

5、進(jìn)行測(cè)定。
　　3.將所獲得的hPDLSCs分激動(dòng)劑組、抑制劑組、DMSO組（對(duì)照組）、正常組進(jìn)行張應(yīng)力加載，并用Western blot測(cè)定對(duì)比各組成骨標(biāo)志蛋白BMP2、Runx2、ALP的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.成功分離獲得了hPDLSCs的原代細(xì)胞，其Vimentin陽性表達(dá)，pan-cytokeratin陰性，CD146和STRO-1陽性，且所獲得細(xì)胞系具有誘導(dǎo)成骨/成脂能力，鑒定確認(rèn)其為hPDLSCs。
　

6、　2.激動(dòng)劑WAY262611和抑制劑XAV939的EC50濃度分別為2.310umol/L和22.99umol/L，EC50濃度下的激動(dòng)劑WAY-262611/抑制劑XAV939能使hPDLSCs的β-catenin表達(dá)增加/下降，調(diào)控hPDLSCs的β-catenin基因表達(dá)。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所選激動(dòng)劑和抑制劑均使hPDLSCs的增殖活力較對(duì)照組有所下降。
　　3.hPDLSCs在外源性張應(yīng)力作用下，成骨相關(guān)標(biāo)志物ALP，

7、Runx2，表達(dá)水平增加。hPDLSCs成骨分化過程中β-catenin表達(dá)水平增加(P＜0.05)，提示β-catenin參與hPDLSCs應(yīng)力成骨過程。
　　4.激動(dòng)劑組與DMSO對(duì)照組相比，成骨標(biāo)志物ALP在動(dòng)態(tài)張應(yīng)力加載后0-12h期間表達(dá)隨時(shí)間遞增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在抑制劑組中，β-catenin及成骨標(biāo)志物表達(dá)未發(fā)現(xiàn)明顯趨勢(shì)。
　　結(jié)論：1.所選濃度激動(dòng)劑WAY262611和抑制劑XAV939作用hPDLSCs