C-EBPβ在脂肪細胞分化過程中的調(diào)節(jié).pdf

1、肥胖癥是指體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布不均勻，體重增加，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。體重的增加，首先是脂肪細胞體積增大，然后脂肪細胞數(shù)目增多。脂肪細胞數(shù)量的增加是由于脂肪組織中存在的干細胞定向為前脂肪細胞，后者在一定因素的作用下，分化為脂肪細胞而形成的。因此研究脂肪細胞分化機制對肥胖的治療具有重要意義。 C／EBPβ在脂肪細胞分化程序中起重要作用。在脂肪細胞分化程序的早期C／EBPβ即有表達，C／EBPβ首先始動有絲分裂

2、克隆擴增(mitoticc1onalexDansion，MCE)，生長抑制的前脂肪細胞重新進入細胞周期，經(jīng)歷兩輪左右的有絲分裂，然后退出細胞周期，進入細胞分化的終末階段，隨后C／EBPβ激活許多脂肪細胞表型基因(如，422／ap2：SCDl：Glut4：0b基因等)的共同轉(zhuǎn)錄激活因子C／EBPα和PPARγ基因的表達。C／EBPβ通過作用于C／EBPα和PPARγ啟動子上的C／EBP調(diào)節(jié)元件發(fā)揮對C／EBPα和PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄激活作

3、用。有絲分裂克隆擴增和C／EBPα以及PPARγ的表達對于脂肪細胞分化均是必需的。因此C／EBPβ通過促進有絲分裂克隆擴增和激活C／EBPα以及PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄，促進脂肪細胞的分化。 在脂肪細胞分化的早期，誘導(dǎo)分化后2個小時內(nèi)C／EBPβ雖有表達，但C／髓PB獲得DNA結(jié)合活性要經(jīng)過很長一段時間的延遲。首先因為抑制因子CHOP-10與C／EBPβ相互作用，抑制C／EBPβ的DNA結(jié)合活性，其次處于低磷酸化狀態(tài)的C／EBPβ具

4、有很低的DNA結(jié)合活性。 CHOP-10是C／EBP家族成員的轉(zhuǎn)錄抑制因子，與C／EBPβ形成異二聚體后，抑制C／EBPβ的DNA結(jié)合活性。在生長抑制的前脂肪細胞，CHOP-10表達很高，經(jīng)誘導(dǎo)分化后，CHOP-10表達下調(diào)，釋放與之形成二聚體的C／EBPβ，C／EBPβ可以進一步磷酸化，獲得D№結(jié)合活性并結(jié)合到著絲粒衛(wèi)星DNA上，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。到目前為止，在脂肪細胞誘導(dǎo)分化早期，CHOP-10表達下調(diào)的原因和機制還不清楚，

5、本文將對此做進一步的研究。 C／EBPBThrl88為MAPK磷酸化位點，對C／EBPβ的DNA結(jié)合活性是必需的，但并不足以激活靶基因。采用MS／MS，我們又鑒定了兩個可能的GSK3B磷酸化位點：Ser84和仆r179。GSK3β磷酸化位點的特征：在其C末端4個氨基酸左右的氨基酸殘基首先發(fā)生磷酸化后，GSK3β才能發(fā)揮作用。我們對C／EBPβSerl84和Thr179位點的磷酸化特征及磷酸化后的C／EBPβ的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄

6、激活功能進行了深入研究，以確定C／EBPβSer184和Thr179位點能否被GSK3B磷酸化；β磷酸化；C／EBPβSerl84和Th179位點的磷酸化是否依賴于MAPK對C／EBPβThr188的磷酸化；C／EBPβ的順序磷酸化(首先MAPK磷酸化Thr188位點，然后GSK3β磷酸化Serl84或Thr179位點)或C／EBPβ的高磷酸化狀態(tài)對C／EBPβ的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄激活功能的影響。 一、CHOP-10在脂肪細胞

7、分化過程中的表達調(diào)節(jié) 在脂肪細胞分化的初期，CHOP-10表達下調(diào)對于C／EBPβ功能的發(fā)揮具有重要意義，因此我們對CHOP-10表達下降的原因進行了深入的研究。在3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化過程中，引入了不同的誘導(dǎo)劑(MDI)，包括0．5mM的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobuty-1-methylxantine，mx)，lμM的地塞米松(Dexamethasone，Dex)，1μg／m1胰島素(Insulin，I)

8、，并將小牛血清換成了胎牛血清，這種改變可能是造成在脂肪細胞分化早期CHOP-10表達下調(diào)的原因。為此我們檢測了不同誘導(dǎo)劑單獨(M，D，I)及不同組合(MD，MI，ID，MDI)對CHOP-10表達的影響。結(jié)果表明，10％胎牛血清(Fetalbovineserum，陽S)本身就足以使CHOP-10表達下調(diào)。而作為對照的10％小牛血清(Calfserum，CS)使CHOP-10維持在很高水平。胎牛血清引起CHOP-10表達下調(diào)對于3T3-L

9、1前脂肪細胞的分化起很重要的作用。因為用小牛血清替代胎牛血清誘導(dǎo)前脂肪細胞分化，使CHOP-10持續(xù)維持在很高的水平，脂肪細胞分化受到明顯抑制，脂肪細胞特異性基因的表達起始明顯延遲，表達的強度也明顯減弱。在本試驗中，我們也發(fā)現(xiàn)CHOP-10的表達與細胞生長周期的關(guān)系不是絕對的，因為在小牛血清的誘導(dǎo)分化方案中，即使細胞重新進入細胞周期(MCE)，細胞仍有很高水平CHOP-10的表達，而在胎牛血清中培養(yǎng)的前脂肪細胞，即使當(dāng)細胞生長到接觸抑制

10、后，細胞內(nèi)CHOP-10仍處于極低水平。以上結(jié)果提示，胎牛血清能下調(diào)生長抑制的前脂肪細胞CHOP-10的表達，而小牛血清能維持生長抑制的前脂肪細胞CHOP-10的表達。 二、FBS引起CHOP-10表達下調(diào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 在脂肪細胞分化的初期，CHOP-10的表達下調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，因此我們檢測了轉(zhuǎn)錄水平FBS對CHOP-10的調(diào)節(jié)。我們構(gòu)建了CHOP-10全長啟動子及5’系列缺失突變體的報告基因表達質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)染用含

11、10％小牛血清的培液及含10％胎牛血清的培液培養(yǎng)的約50％-60％的前脂肪細胞，當(dāng)前脂肪細胞生長至接觸抑制兩天后，裂解細胞，檢測報道基因活性，從而確定CHOP-10啟動子上可能的胎牛血清反應(yīng)元件的位置。CH0P-10啟動子的5’系列缺失突變體報道基因活性分析表明在-578bp到-321bp區(qū)域存在可能的FBS反應(yīng)元件，采用計算機分析軟件分析此區(qū)域含有對血清刺激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子SRF(Serumresponsefactor)和YYl(Yin

12、Yang1)的結(jié)合位點。GMSA表明SRF不能結(jié)合到CHOP-10啟動子SRE(Serumresponseelement)位點上；YY1不僅能結(jié)合到此區(qū)域的YY1位點，也能結(jié)合到S旺位點，并且在胎牛血清培液培養(yǎng)的細胞與小牛血清培液培養(yǎng)的細胞中YYl結(jié)合到CHOP一10啟動子上的能力存在差異。在胎牛血清培養(yǎng)的細胞中，有更多YY1結(jié)合到CHOP—lO啟動子上的Y¨或SRE位點上。盡管YYl具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制雙重功能，但在CHOP—10啟

13、動子上結(jié)合的特點提示，YYl可能對CHOP—10啟動子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的功能。YYl在CHOP一10啟動子上結(jié)合的差異可能是導(dǎo)致胎牛血清培液培養(yǎng)的細胞與小牛血清培液培養(yǎng)的細胞中CHOP一10表達差異的原因，也是脂肪細胞分化早期，F(xiàn)BS引起CHOP一10表達下調(diào)的原因。 三、C／髓PB的磷酸化調(diào)節(jié) 我們深入研究了GSK3β對C／EBPβSer184和Thr179位點的磷酸化特征及與已知的C／EBPβThr188的MAPK磷酸化

14、位點之間的關(guān)系和磷酸化后對C／EBPβ的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄激活功能的影響。體外磷酸化實驗及功能研究表明單獨的MAPK能使E.coli.中表達的野生型C／EBPβ蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化，MS／MS結(jié)果表明磷酸化位點是C／EBPβThr188位的MAPK磷酸化位點，此時C／EBPβ的DNA結(jié)合活性仍很低。單獨的GSK3β不能使C／EBPβ發(fā)生磷酸化。當(dāng)MAPK與GSK3β共同作用時，C／EBPβ的磷酸化明顯增強，MS／MS結(jié)果表明C／EBPβ磷

15、酸化發(fā)生在Thr188位和Serl84位或Thr188位和Thr179位，為雙磷酸化位點，此時C／雎PB的D№結(jié)合活性明顯增強。說明GSK3B需要在姒PK對C／EBPβThr188位首先發(fā)生磷酸化后，才能使C／EBPβThr179和Serl84位點磷酸化。如果將Thr188，Thr179和Ser184位點均突變成丙氨酸，則MAPK和／或GSK3β均不能使突變的C／EBPβ蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化，C／EBPβ也沒有DNA結(jié)合活性，進一步說明C／

16、EBPβ發(fā)生系列磷酸化對于C／EBPβDNA結(jié)合活性的重要性。我們針對以上3個位點構(gòu)建了C／EBPβ的一系列突變體，以觀察高磷酸化的C／EBPβ是否具有更好的轉(zhuǎn)錄激活功能。結(jié)果表明，隨著C／EBPβ突變成谷氨酸位點的增多(類似體內(nèi)磷酸化)，C／EBPβ對C／EBPα啟動子的轉(zhuǎn)錄激活功能增強，而隨著C／EBPβ突變成丙氨酸位點的增多(類似體內(nèi)去磷酸化)，C／EBPβ的轉(zhuǎn)錄激活功能降低。以上結(jié)果表明，C／EBPβThrl79和Serl84位