柑桔潰瘍病菌重組單鏈抗體的高效表達(dá)及穩(wěn)定性改造.pdf

1、柑桔潰瘍病(citrus bacterial canker disease，CBCD)是影響全球柑桔種植業(yè)發(fā)展的重大檢疫性病害，其病原菌為地毯草黃單胞柑桔致病變種(Xanthomonas axonopodis pv. citri)，是國內(nèi)外重大檢疫性有害生物。長期以來由于缺乏抗病品種和特效的化學(xué)防治藥劑，對該病的防治主要采取加強(qiáng)非疫區(qū)建設(shè)與植物檢疫來嚴(yán)防病害的傳播，對病樹采取挖除并集中燒毀的根除措施。目前國內(nèi)外正在實施的柑桔非疫生產(chǎn)區(qū)建

2、設(shè)，強(qiáng)化植物檢疫，嚴(yán)防疫害傳入的監(jiān)控策略，迫切需要建立快速、特異、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)及防控措施。
　　基因工程重組單克隆抗體(recombination monoclonal antibody，RMA)是90年代以來，人們利用基因工程重組技術(shù)，有目的地在基因水平上對抗體分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，或者直接合成基因序列，再將重組DNA或重組蛋白基因?qū)爰?xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的一類抗體，兼具治療和診斷雙重功能。利用抗原－抗體特異性結(jié)合原理，可用于人類

3、疾病、植物病害的診斷、治療和預(yù)防。單鏈抗體(single chain variable fragment，ScFv)是利用基因工程的方法用一連接肽將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)拼接在一起的重組蛋白，由于其低或無免疫原性、分子量小、組織穿透力強(qiáng)，成本低，可大規(guī)模生產(chǎn)等特點已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但是，國內(nèi)外單鏈抗體ScFv應(yīng)用于植物病害方面的研究報道寥寥無幾，且抗柑桔潰瘍病菌的重組基因工程抗體高表達(dá)體系的建立以及穩(wěn)定性改造方

4、面的研究尚未見報道。
　　本研究的目的就是針對現(xiàn)有的柑桔潰瘍病快速檢測技術(shù)體系尚未完善，并且傳統(tǒng)上柑桔潰瘍病的檢測方法如 PCR，噬菌體檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和斑點免疫結(jié)合法(DIA)等在一定程度上存在著檢測周期長、操作復(fù)雜、靈敏度不高，不能很好的滿足檢疫工作的要求的缺點，應(yīng)用高產(chǎn)重組單鏈抗體結(jié)合膠體金技術(shù)為柑桔潰瘍病菌XAC的免疫診斷和防治研究提供新的工具和途徑。
　　研究內(nèi)容主要包括：運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增利用

5、核糖體展示技術(shù)篩選的抗柑桔潰瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri，XAC)的單鏈抗體(ScFv95)基因片段，將單鏈抗體基因重組到原核表達(dá)載體 pET30a(+)中，構(gòu)建單鏈抗體高效表達(dá)載體pET30a(+)-XAC-ScFv。再將pET30a(+)-XAC-ScFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化、復(fù)性及活性檢測，隨后對抗體的穩(wěn)定性進(jìn)行初步改造從而為柑橘潰瘍病菌的血

6、清學(xué)診斷提供新型的診斷試劑，而且還可用于進(jìn)一步研究柑橘潰瘍病菌與寄主的初步識別機(jī)制，為柑橘潰瘍病菌的生物防治提供理論依據(jù)。論文主要研究結(jié)果如下：
　　①成功擴(kuò)增抗柑桔潰瘍病菌的單鏈抗體 ScFv基因，將其進(jìn)行酶切后與載體pET30a(+)相連并轉(zhuǎn)化進(jìn)了大腸桿菌BL21(DE3)中。
　?、诓捎肐PTG誘導(dǎo)的包涵體表達(dá)方式進(jìn)行抗體的表達(dá)，將包涵體裂解物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，顯示在32 kDa處有一蛋白條帶產(chǎn)生。將表達(dá)產(chǎn)物采

7、用His-tag蛋白純化試劑盒純化后進(jìn)行SDS-PAGE顯示，在32 kDa同樣有一蛋白條帶產(chǎn)生。為了進(jìn)一步驗證表達(dá)的蛋白即目的蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了Western blot雜交，結(jié)果顯示，與純化后的電泳結(jié)果一致，在32 kDa處有單一的條帶產(chǎn)生，說明表達(dá)純化的蛋白即目的蛋白。
　?、鄄捎媚z(Sephacryl-200HR)柱上在位復(fù)性對蛋白進(jìn)行活性再生，通過斑點雜交檢測復(fù)性后蛋白的活性，結(jié)果顯示蛋白通過凝膠層析復(fù)性已成功獲得原

8、有的生物功能。提取柑橘潰瘍病菌LPS及柑橘潰瘍病菌近源種甘藍(lán)黑腐病菌（XCC） LPS、水稻條斑病菌（XOO）LPS、水稻白葉枯（XOOc）LPS，LPS用HEPPES緩沖液（10 mmol/L HEPES,100 mmol/L NaCL pH7.4）稀釋成5μg/ml，以30μL/min注入。用Biacore evauation軟件分析單鏈抗體親和力，分析結(jié)果顯示復(fù)性后的重組抗體只跟柑橘潰瘍病菌LPS具有較高的結(jié)合力，親和常數(shù)KA（k