抗TfR單鏈抗體及其雙價抗體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定.pdf

1、本文研究了抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體及其雙價抗體(BsFv)的構(gòu)建，表達(dá)及其與細(xì)胞結(jié)合的活性與特異性鑒定。 方法 1.通過酶切與亞克隆構(gòu)建抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體(scFv)； 2.以抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體scFv為模板，設(shè)計引物引入中間連接肽(G4S)及酶切位點AscI，通過PCR方法擴增出兩個scFv片段，將其連接，并克隆至原核表達(dá)載體pAB1，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑取單克隆細(xì)菌進行擴增，提取質(zhì)粒酶切、測序鑒定；

2、 3.IPTG誘導(dǎo)單鏈抗體及其雙價抗體表達(dá)，Ni-NTA層析柱純化抗體，收集純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，Westernblot鑒定； 4.通過FCM測定純化單鏈抗體及其雙價抗體與細(xì)胞結(jié)合特異性與活性。 結(jié)果 1.隨機挑選轉(zhuǎn)化板上的菌落提取質(zhì)粒，SfiI、NotI酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見一條約750bp和1500bp的陽性條帶，分別與單鏈抗體和雙價抗體基因大小理論值符合。雙價抗體測序結(jié)果與原單鏈抗體以及

3、PCR引物比對正確。證明抗TfR單鏈抗體和雙價抗體構(gòu)建成功，并均已克隆至分泌性表達(dá)載體pAB1中； 2.IPTG誘導(dǎo)單鏈抗體及其雙價抗體表達(dá)，可溶性蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE分析，Westernblot檢測，可見約30KD和60KD大小的條帶，分別與單鏈抗體和雙價抗體理論值一致； 3.將純化的單鏈抗體，雙價抗體分別與K562，HepG2，靜止外周血淋巴細(xì)胞進行結(jié)合，F(xiàn)CM檢測與細(xì)胞結(jié)合的陽性率結(jié)果顯示，雙價抗體與K56

4、2結(jié)合的陽性率約60％左右，與HepG2結(jié)合的陽性率為23％左右，高于單鏈抗體，且單鏈抗體，雙價抗體與靜止外周血淋巴細(xì)胞結(jié)合陽性率基本一致。表明構(gòu)建的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體與雙價抗體均具有與K562及Hela細(xì)胞表面TfR結(jié)合的特異性，雙價抗體親合力較單鏈抗體有所提高。 結(jié)論 成功構(gòu)建與表達(dá)抗TfR的單鏈抗體與雙價抗體，并證明其具有與K562，HepG2細(xì)胞表面TfR結(jié)合的活性及特異性，雙價抗體親合力較單鏈抗體有所增強。