抗氧化治療阻止非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展的機(jī)制.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic stea-tohepatitis，NASH)是由于肝內(nèi)脂質(zhì)沉積而引起的肝細(xì)胞壞死、炎癥和纖維化等肝損傷，是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)由單純性肝脂肪變向肝硬化甚至肝癌進(jìn)展的重要階段，NASH導(dǎo)致的肝硬化具有與乙、丙型肝炎肝硬化相同的不良預(yù)后。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其日益關(guān)注，研究不斷深入，但其病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，在防治

2、上亦缺乏有效手段。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激(oxidative stress)是NASH發(fā)病的重要因素之一，改善氧化應(yīng)激可能有助于防止本病的進(jìn)展。1-氨基苯丙三唑(1-amino-benzotriazole，ABT)及維生素E作為抗氧化劑，能明顯減輕組織對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性。ABT屬于細(xì)胞色素P450(cytochro-me P450，CYP)拮抗劑，人體內(nèi)CYP是位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一組混合功能氧化酶系，是肝臟代謝最主要的酶系之一，它主要定位于肝

3、微粒體，CYP在NASH發(fā)病中的作用及其機(jī)制目前尚未明確。維生素E(vitamin E，Vit E)是一種脂溶性維生素，它能清除自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化過程中的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免受損害。本研究采用高脂、膽堿-蛋氨酸缺乏(high fat，methionine and choline deficient diet，MCD)飲食建立小鼠NASH模型，應(yīng)用CYP抑制劑ABT干預(yù)治療，以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcri

4、ption-polymerase chainreaction，RT-PCR)方法和Western blot法研究細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)、Bax在NASH小鼠肝組織中的表達(dá)情況及其與病情進(jìn)展的關(guān)系，以探討CYP被ABT抑制及阻斷脂質(zhì)過氧化過程中的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，氧化應(yīng)激在NASH發(fā)病中的作用及其機(jī)制，是否可抑制Cyt C及Bax的表達(dá)，延緩或阻止NASH的進(jìn)展，以進(jìn)一步揭示改善氧化應(yīng)激在NASH中的作用，為有效防治

5、本病提供新的思路。 方法：選用健康雄性C57BL6/J小鼠25只，隨機(jī)分為5組，每組5只。模型組采用MCD飼料，對(duì)照組給予膽堿、蛋氨酸充足的飼料，ABT干預(yù)組以MCD飼料加ABT腹腔注射(50mg/kg/d)，維生素E干預(yù)組以MCD飼料加喂養(yǎng)維生素E(100mg/kg飼料)，ABT+維生素E干預(yù)組以MCD飼料加喂養(yǎng)維生素E(100mg/kg飼料)+ABT腹腔注射(50mg/kg/d)，喂養(yǎng)3周。血清甘油三酯(triglyceri

6、de，TG)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate amino-transferase，AST)采用日本Olympus AU 2700全自動(dòng)生化分析儀測定；肝組織病理學(xué)變化采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H&E)，蘇丹IV(Sudan IV)染色觀察；肝組織Cyt C mRNA及Bax mRNA和蛋白表達(dá)分別采用RT-PCR和West

7、ern blot檢測。 結(jié)果： 1.動(dòng)物一般情況：對(duì)照組小鼠活潑、毛發(fā)有光澤，體重逐漸增加。模型組和ABT干預(yù)組、維生素E干預(yù)組、ABT+維生素E干預(yù)組小鼠體重均下降，尤以模型組明顯。對(duì)照組小鼠體重、肝濕重均較模型組和干預(yù)組增加顯著(16.96±1.38g、27.23±1.10g、17.84±0.86g、17.27±0.92g、17.82±0.86g，0.70±0.15g、1.12±0.16g、0.74±0.11g、0.

8、76±0.17g、0.78±0.19g，P<0.05)，模型組體重、肝重與ABT干預(yù)組、維生素E干預(yù)組、ABT+維生素E干預(yù)組相比差異有顯著性意義。肝臟指數(shù)：模型組與對(duì)照組、干預(yù)組差別無顯著性意義(4.17±0.26、3.91±0.34、3.98±0.28、4.11±0.15、4.13±0.21，P>0.05)。 2.血清生化學(xué)改變：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ALT水平模型組>MCD-+Vit E干預(yù)組>MCD-+ABT干預(yù)組>MCD+干預(yù)組>

9、MCD-+Vit E+ABT，依次為：245.33±8.02U/L、184.67±18.23U/L、161.00±13.89 U/L、151.33±12.86 U/L、129.33±13.65 U/L，P<0.01；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AST水平模型組>MCD-+Vit E干預(yù)組>MCD-+ABT干預(yù)組>MCD+干預(yù)組>MCD-+Vit E+ABT，依次為：330.67±15.04 U/L、201.67±28.04 U/L、197.67±20.03

10、U/L、135.00±8.72 U/L、125.67±4.51 U/L，P<0.05；血清TG水平模型組>MCD-+干預(yù)組>MCD-+ABT干預(yù)組>MCD-+VitE干預(yù)組>MCD-+Vit E+ABT，依次為：0.72±0.04mmol/L、0.56±0.07 mmol/L、0.38±0.03 mmol/L、0.36±0.04 mmol/L、0.33±0.03 mmol/L，P<0.05。 3.肝臟病理學(xué)變化：肉眼觀察：對(duì)照組

11、小鼠肝臟為紅褐色，明亮有光澤。模型組小鼠肝臟體積明顯減小，整個(gè)肝臟呈淺黃色，與周圍組織有粘連，切面油膩、無光澤。干預(yù)組小鼠肝臟體積亦有縮小，為紅褐色、有光澤。光鏡觀察：對(duì)照組肝細(xì)胞輕度脂肪變，無明顯炎癥表現(xiàn)；模型組肝細(xì)胞腫脹、水樣變，并形成以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變，伴有小葉內(nèi)點(diǎn)、灶狀肝細(xì)胞壞死及以單個(gè)核為主的炎癥細(xì)胞浸潤；Vit E及ABT干預(yù)組上述肝損傷較模型組均明顯減輕，VitE+ABT干預(yù)組肝細(xì)胞脂肪變及炎癥均較輕微。 4 肝組

12、織細(xì)胞色素C mRNA的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)水平依次為：模型組>對(duì)照組>維生素E干預(yù)組>ABT干預(yù)組>ABT+維生素E干預(yù)組(1.26±0.04、1.14±0.08、1.04±0.03、1.00±0.02、0.99±0.01，P<0.01)，差異具有顯著性意義。 5.肝組織細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)情況：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織細(xì)胞色素C蛋白水平表達(dá)與mRNA表達(dá)一致，依次為：模型組>對(duì)照組>維生素E干預(yù)組>ABT干預(yù)組>

13、ABT-+維生素E干預(yù)組(1.06±0.01、0.96±0.01、0.85±0.02、0.84±0.02、0.80±0.02，P<0.01)，差異具有顯著性意義。 6.肝組織Bax mRNA表達(dá)情況：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織BaxmRNA表達(dá)水平依次為：模型組>對(duì)照組>維生素E干預(yù)組>ABT干預(yù)組>ABT+維生素E干預(yù)組(0.83±0.03、0.77±0.02、0.71±0.01、0.73±0.03、0.70±0.02，P<0.01)，差

14、異具有顯著性意義。 7.小鼠肝組織Bax蛋白表達(dá)情況：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織Bax蛋白表達(dá)水平依次為：模型組>對(duì)照組>維生素E干預(yù)組>ABT干預(yù)組>ABT+維生素E干預(yù)組(0.55±0.02、0.42±0.01、0.40±0.02、0.40±0.01、0.37±0.01，P<0.01)，差異具有顯著性意義。 結(jié)論： 1.高脂、膽堿-蛋氨酸缺乏飲食3周可誘導(dǎo)具有典型NASH臨床特征的肝損傷動(dòng)物模型，此模型符合人類NASH發(fā)