杞薊制劑防治非酒精性脂肪性肝炎大鼠的分子機(jī)制.pdf

1、目的：隨著人民生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)發(fā)病逐漸增多。其病理機(jī)制比較復(fù)雜，有廣泛的因素參與，迄今尚未完全闡明。其中，游離脂肪酸(freefattyacids，F(xiàn)FA)過(guò)多、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子(cytokines，CKs)相關(guān)性損害等是其重要的病理環(huán)節(jié)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)是與氧化應(yīng)激(oxidativestress)、

2、CKs相關(guān)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種促炎因子基因的表達(dá)，推測(cè)在NASH發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。NASH尚無(wú)理想的防治藥物。中醫(yī)在防治NASH方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。導(dǎo)師張赤志教授臨床體會(huì)：NASH多因長(zhǎng)期過(guò)食肥甘，痰濕內(nèi)生，致脾失健運(yùn)，肝失疏泄，郁久化熱，暗耗陰精，形成本虛標(biāo)實(shí)的病理特點(diǎn)。治宜滋補(bǔ)肝腎、清熱利濕。臨床應(yīng)用杞薊制劑(枸杞子水提物、水飛薊賓組成)治療NASH取得很好效果。本課題采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的研究模型，結(jié)合NASH的現(xiàn)代研究成

3、果，用病理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)，探討NASH狀態(tài)下肝組織NF-κB及其抑制因子(inhibitorofnuclearfactor-κB，IκB)蛋白和mRNA表達(dá)情況，闡明杞薊制劑的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療本病提供理論依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行： 第一部分：杞薊制劑藥效學(xué)研究(實(shí)驗(yàn)Ⅰ)清潔級(jí)SD大鼠，80只，雌雄各半，體重190±20g。普通飼料正常喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為8組，每組10只。正常對(duì)照組(A組)、空白

4、模型組(B組)、杞薊制劑小劑量組(C1組)、杞薊制劑中劑量組(C2組)、杞薊制劑大劑量組(C3組)、西藥對(duì)照組(復(fù)方蛋氨酸膽堿片組，D組)、枸杞子組(E組)、水飛薊賓組(F組)。參考鐘嵐等報(bào)道的方法配制高脂飼料(在普通飼料基礎(chǔ)上加10％豬油、2％膽固醇)，用之復(fù)制大鼠NASH模型。8周后各造模組繼用高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)，將杞薊制劑稀釋成1：2：4不同濃度(最低劑量為中藥常規(guī)劑量提取物)，C1、C2、C3組分別按不同濃度杞薊制劑混懸液1ml/

5、100g.d灌胃，每日1次；D組予東寶肝泰混懸液0.09g/1ml/100g.d灌胃，每日1次；B組予生理鹽水1ml/100g.d灌胃，每日1次；E組、F組分別予枸杞子水提物、水飛薊賓混懸液1ml/100g.d灌胃，每日1次。給藥4周后(即實(shí)驗(yàn)12周)，所有大鼠禁食12h，以2％戊巴比妥鈉溶液麻醉處死所有動(dòng)物，迅速分離血清，提取肝組織。于模型建立及給藥期間觀察記錄動(dòng)物體重、食欲、行為、狀態(tài)、毛發(fā)及死亡情況。計(jì)算肝指數(shù)。用OlympusA

6、u560全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)。肝組織中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，評(píng)估脂肪變性和炎癥活動(dòng)程度。 第二部分：NASH的分子機(jī)制及杞薊制劑的藥理學(xué)研究(實(shí)驗(yàn)Ⅱ-Ⅴ)動(dòng)物分組：清潔級(jí)SD大鼠，40只，雌雄各半體重190±20g。普通飼料正常喂養(yǎng)

7、1周，隨機(jī)分為4組，每組10只：正常對(duì)照組(A組)、空白模型組(B組)、杞薊制劑組(C組)、復(fù)方蛋氨酸膽堿片組(D組)。模型復(fù)制方法同實(shí)驗(yàn)Ⅰ。8周后各模型組繼用高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)，B組子生理鹽水1ml/100g.d灌胃，每日1次；C組予杞薊制劑混懸液1ml/100g.d灌胃(按前三個(gè)計(jì)量組中最優(yōu)劑量組劑量)，每日1次；D組予東寶肝泰混懸液0.09g/1ml/100g.d灌胃，每日1次。取材方法同實(shí)驗(yàn)Ⅰ。用0lympusAu560全自動(dòng)生化

8、分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(totalcholesterol，TCH)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)。取肝右葉1g，4℃下制成10％肝勻漿，按試劑盒操作說(shuō)明分別測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、游離脂肪酸(

9、freefattyacids，F(xiàn)FA)水平。肝組織中性富爾馬林固定，石蠟包埋，切片，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織腫瘤壞死因子-α(thetumornecrosisfactor-α，TNF-a)、P65、IκB-a蛋白的表達(dá)。肝組織用含4％多聚甲醛的PBS緩沖液固定，石蠟包埋，切片，原位雜交技術(shù)檢測(cè)肝組織P65(NF-κB亞型)、IκB-a(IκB亞型)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：第一部分：杞薊制劑藥效學(xué)研究(實(shí)驗(yàn)Ⅰ)實(shí)驗(yàn)中，8組大鼠體重

10、增長(zhǎng)速度一致，食欲、行為、毛發(fā)皆無(wú)明顯異常，部分組鼠可能因相互撕咬而死亡。根據(jù)模型組大鼠肝組織病理及肝功能狀態(tài)，成功復(fù)制大鼠NASH動(dòng)物模型。與空白模型組相比，杞薊制劑各劑量組大鼠肝指數(shù)顯著降低(P＜0.01)，肝組織炎癥活動(dòng)程度顯著改善(P＜0.01)，血清ALT、AST明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，明顯優(yōu)于枸杞子組、水飛薊賓組及復(fù)方蛋氨酸膽堿片對(duì)照組(P＜0.01或P＜0.05)。杞薊制劑大，中劑量組之間各項(xiàng)指標(biāo)及各造模組

11、脂肪變性程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 第二部分：NASH的分子機(jī)制及杞薊制劑的藥理學(xué)研究(實(shí)驗(yàn)Ⅱ-Ⅴ)①NASHNF-κB/IκB的表達(dá)：正常組大鼠肝組織P65、IκB-a蛋白和mRNA皆有表達(dá)，主要在胞漿分布；與正常組相比，空白模型組大鼠肝組織P65、IκB-a蛋白和mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)；P65蛋白胞核表達(dá)明顯，胞漿亦有分布；IκB-a蛋白主要在胞漿表達(dá)。 ②杞薊制劑對(duì)NASH血脂及肝組織FF

12、A水平的影響：與空白模型組相比，杞薊制劑組大鼠血清TG、TCH、LDL及肝組織FFA水平明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)，優(yōu)于復(fù)方蛋氨酸膽堿片對(duì)照組(P＜0.05)。HDL水平無(wú)明顯差異(P＞0.05) ③杞薊制劑對(duì)NASH氧化及抗氧化狀態(tài)的影響：與空白模型組相比，杞薊制劑組大鼠肝組織SOD水平顯著提高(P＜0.01)，MDA含量顯著降低(P＜0.01)，優(yōu)于復(fù)方蛋氨酸膽堿片對(duì)照組(P＜0.01)。 ④杞薊制劑對(duì)N

13、ASHTNF-α蛋白表達(dá)的影響：與空白模型組相比，杞薊制劑組大鼠肝組織TNF-α蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，優(yōu)于復(fù)方蛋氨酸膽堿片對(duì)照組(P＜0.01)。 ⑤杞薊制劑對(duì)NASHNF-κB/IκB表達(dá)的影響：與空白模型組相比，杞薊制劑組大鼠肝組織P65、IκB-a蛋白和mRNA的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，優(yōu)于復(fù)方蛋氨酸膽堿片組(P＜0.05)；復(fù)方蛋氨酸膽堿片組大鼠肝組織P65、IκB-a蛋白和mRNA的表達(dá)雖能有所降低，

14、但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論：1.NF-κB及其抑制因子IκB與NASHNASH大鼠肝組織P65、IκB-a蛋白和mRNA表達(dá)增強(qiáng)，P65蛋白胞核表達(dá)明顯，IκB-a蛋白主要表達(dá)于胞漿。提示NASH狀態(tài)下NF-κB啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄能力增強(qiáng)，是TNF-a等表達(dá)增強(qiáng)的重要因素，是機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)及纖維化的重要機(jī)制。而IκB-a蛋白和mRNA的表達(dá)與NF-κB同步增強(qiáng)可能是由共同機(jī)制調(diào)節(jié)的結(jié)果，結(jié)合NF-κB核移位增強(qiáng)情況

15、，提示NASH狀態(tài)下I-κB氧化磷酸化解離增加，參與了NASH的發(fā)病。 2.杞薊制劑防治NASH的作用杞薊制劑具有多靶位防治NASH的作用，優(yōu)于復(fù)方蛋氨酸膽堿片： ①對(duì)肝組織病理及肝功能狀態(tài)的影響：杞薊制劑預(yù)防給藥，能明顯降低NASH大鼠肝指數(shù)，改善炎癥活動(dòng)程度及肝功能，優(yōu)于枸杞子組、水飛薊賓組及復(fù)方蛋氨酸膽堿片。說(shuō)明杞薊制劑能夠防治實(shí)驗(yàn)性大鼠NASH發(fā)病，枸杞子和水飛薊賓具有協(xié)同作用。對(duì)肝組織脂肪變性未顯示影響，可能是

16、由于分級(jí)方法粗略的緣故。比較杞薊制劑小、中、大劑量組，杞薊制劑在防治NASH方面存在一定的量效關(guān)系，綜合評(píng)估以中劑量組為優(yōu)。 ②對(duì)血脂及肝組織游離脂肪酸水平的影響：杞薊制劑降低血清脂質(zhì)、肝組織游離脂肪酸水平，從而減少FFA的肝臟毒性和TG積聚。 ③對(duì)氧化及抗氧化狀態(tài)的影響：杞薊制劑提高肝組織抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)過(guò)氧化。 ④對(duì)TNF-α蛋白表達(dá)的影響：杞薊制劑降低TNF-α蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞因子相關(guān)