二色補血草鹽腺發(fā)育機制的初步研究.pdf

1、全世界的土壤鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴重,鹽漬化土壤正在向耕地蔓延,經(jīng)濟發(fā)展、糧食和能源安全正面臨著嚴峻的威脅。我國鹽漬化土壤面積及次生鹽漬化程度都高于世界平均值。傳統(tǒng)工程學(xué)手段改造鹽堿地存在很多弊端,易造成土壤次生鹽漬化,成本巨大不利于可持續(xù)地改造鹽堿地。所以,發(fā)展一種新的鹽生植物用于抗鹽機理研究,充分挖掘其潛在的抗鹽基因,就顯得尤為重要,對于提高農(nóng)作物的抗鹽水平和改良鹽堿地意義重大。鹽堿地中廣泛分布的泌鹽鹽生植物具有典型的鹽腺和鹽囊泡,是區(qū)別

2、于其他鹽生植物和所有非鹽生植物唯一可見的結(jié)構(gòu)特點,可以將體內(nèi)過量積累的鹽離子排出體外從而避免了鹽脅迫,這種泌鹽鹽生植物就提供了良好的抗鹽性研究材料。
　　從上世紀50年代開始,泌鹽鹽生植物的研究大部分集中于鹽腺結(jié)構(gòu)和泌鹽機理上,但是探討鹽腺真正的抗鹽機理關(guān)鍵在于鹽腺的發(fā)育機制,從根本上揭示鹽腺的發(fā)育機制對于真正解釋鹽生植物耐鹽機理、培育耐鹽作物、進而改良鹽漬化土地具有重大意義。本研究利用具有典型鹽腺的二色補血草(Limonium

3、bicolor)為實驗材料,從細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)兩個方面探索鹽腺的發(fā)育機制,旨在研究鹽腺的分化方式和篩選控制鹽腺發(fā)育的關(guān)鍵基因。
　　培育二色補血草為一種研究抗鹽性的模式鹽生植物,面臨著一系列瓶頸問題:高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立;飽和突變體庫的獲得;縮短生長周期以及能否自花授粉獲得純合突變體;全面的基因組/轉(zhuǎn)錄組注釋等等。本論文針對如上問題進行了探索,主要結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了以二色補血草葉片為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)

4、化體系
　　首先設(shè)計不同種類及濃度的生長調(diào)節(jié)劑配比,以無菌培養(yǎng)1個月的二色補血草六葉期幼苗的葉片為外植體,篩選最佳再生培養(yǎng)條件,獲得最佳芽再生培養(yǎng)基是MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L NAA,再生率達到96％以上,最適根再生培養(yǎng)基是MS+0.5mg/L IBA。然后探索了根癌農(nóng)桿菌侵染的各個參數(shù)設(shè)置,采用含有pTCK303質(zhì)粒的EHA105菌株,攜帶有GUS報告基因以及潮霉素抗性基因等,侵染濃度為0.6-0.7(OD60

5、0),經(jīng)與葉片共培養(yǎng)4天后,置于篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株,芽篩選培養(yǎng)基在芽再生培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加8mg/L潮霉素和600mg/L哌拉西林鈉,根篩選培養(yǎng)基是根再生培養(yǎng)基中添加8mg/L潮霉素。對轉(zhuǎn)基因植株進行GUS染色后呈現(xiàn)陽性,結(jié)合定量PCR檢驗和northern雜交的陽性檢驗結(jié)果,我們獲得轉(zhuǎn)基因效率為4.43%。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系為將來的轉(zhuǎn)基因驗證鹽腺發(fā)育及泌鹽基因的功能提供了保障,使二色補血草鹽腺發(fā)育的研究具有了可行性。

6、>　　2.獲得了鹽腺發(fā)育及泌鹽的突變體,確定了二色補血草花的授粉方式
　　利用EMS化學(xué)誘變和60Cogamma輻射誘變兩種方式,探索適合于二色補血草種子的最佳誘變處理方法,由于EMS化學(xué)誘變引起的單堿基對的改變,并未獲得鹽腺發(fā)育的突變體,但是在gamma射線120Gy的劑量下可以獲得鹽腺發(fā)育的突變體,輻射誘變約30,000粒種子,經(jīng)自發(fā)熒光篩選鑒定后獲得19株鹽腺發(fā)育異常的突變體M0代,經(jīng)葉圓盤分泌檢測后進一步鑒定出泌鹽能力顯著

7、增加/減少的突變體。由于自交才有可能最大程度的保存突變體性狀,所以本論文同樣討論了二色補血草花的授粉方式,經(jīng)單株隔離后,觀察花粉管的萌發(fā)情況和收獲種子能力,我們鑒定二色補血草具有自花授粉的能力,單株獲得約200粒種子,為突變純合體的篩選奠定了基礎(chǔ),鹽腺發(fā)育及泌鹽突變體為后期驗證鹽腺發(fā)育及泌鹽的關(guān)鍵基因提供了材料準備,也為以后創(chuàng)建二色補血草鹽腺發(fā)育及泌鹽飽和突變體庫奠定了基礎(chǔ)。
　　3.確定了二色補血草葉片及鹽腺的分化模式
　

8、　利用兩個典型的發(fā)育時期,生長一個月的幼嫩六葉期和三個月的成熟大葉期葉片,探索二色補血草葉片及鹽腺的分化模式。對于同一葉片而言,隨著葉面積的不斷伸展,鹽腺密度不斷下降,鹽腺密度與葉面積的增長呈反比。不同葉位的葉片鹽腺的分布規(guī)律:隨著葉位的不斷上升,單個葉片的鹽腺總數(shù)呈上升的趨勢。二色補血草葉片的鹽腺泌鹽速率和鹽腺分泌總量,均與葉面積的增加呈正比。
　　我們進一步觀察分化早期的葉片及子葉上鹽腺的發(fā)育方式,證實鹽腺的起始細胞是鹽腺母細

9、胞經(jīng)輻射對稱分裂形成可見的四細胞結(jié)構(gòu),最后形成十六細胞的結(jié)構(gòu)。通過子葉和真葉的分化跟蹤發(fā)現(xiàn),鹽腺的分化成熟早于氣孔2天,子葉上的鹽腺四細胞結(jié)構(gòu)與氣孔的擬分生組織的結(jié)構(gòu)共存,直到鹽腺分化成熟才開始氣孔的分化。非損傷微測的結(jié)果顯示,真葉上的鹽腺一旦分化成熟就具有了較強的分泌能力,這樣就為二色補血草的幼苗早期抗鹽性提供了保障。
　　利用微分干涉差顯微鏡和透射電子顯微鏡對第一片真葉的分化跟蹤,發(fā)現(xiàn)第一片真葉的分化共經(jīng)歷了5個時期:未分化時

10、期、鹽腺分化時期、氣孔分化時期、表皮細胞分化時期和成熟期,每個時期均有特異的時間段,而且各個發(fā)育時期有明確的時間間隔,與子葉分化模式不同的是,在鹽腺分化成熟后氣孔擬分生組織開始出現(xiàn)并迅速分化為成熟氣孔。對葉片不同發(fā)育時期的鹽腺超微結(jié)構(gòu)的觀察顯示,二色補血草鹽腺具有明顯的結(jié)構(gòu)特點:外被加厚的角質(zhì)層;鹽腺細胞之間以及鹽腺和葉肉細胞之間大量的胞間連絲;巨大多嵴的線粒體;大量的小囊泡積累(沒有中央大液泡);沒有葉綠體;具有獨特的自發(fā)熒光現(xiàn)象;而

11、且隨著分化時間的延長,線粒體更加發(fā)達,胞間連絲和小囊泡劇烈增加,出現(xiàn)大量的囊泡與細胞膜融合的現(xiàn)象。
　　4.二色補血草葉片發(fā)育轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建
　　基于葉片發(fā)育的不同時期的劃分,本研究進一步進行了葉片發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組測序,分別大量富集二色補血草5個發(fā)育時期的真葉,提取純化mRNA后,構(gòu)建cDNA文庫,利用Illumina HiSeq2000測序儀進行測序,產(chǎn)生雙向各100bp的測序讀長,經(jīng)denovo拼接后與Nr數(shù)據(jù)庫(non-re

12、dundant protein database)進行比對注釋后,利用DEseq方法篩選到各時期的差異表達基因共4,696個,K-means聚類后獲得16個具有不同發(fā)育時期特異性的cluster,而且DAVID分析顯示各cluster具有不同的功能富集。集中分析鹽腺發(fā)育時期和未分化時期的差異表達基因,共發(fā)現(xiàn)72個基因可能與鹽腺的發(fā)育有關(guān),隨機選取26個拼接的轉(zhuǎn)錄本,通過Real-time PCR證實與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果相關(guān)性較高,利用鹽腺發(fā)育

13、增加的突變體同樣驗證了這些基因參與了鹽腺的分化。針對未分化時期的差異表達基因分析顯示控制鹽腺的分化基因與腺毛具有較高的同源性,而且鹽腺的分化方式同樣暗示了與腺毛具有類似的發(fā)育模式,據(jù)此我們推測,鹽腺與腺毛具有共同的起源。
　　5.利用葉片鹽腺泌鹽轉(zhuǎn)錄組,篩選既參與鹽腺分化又決定泌鹽能力的關(guān)鍵基因
　　利用200mM NaCl處理下具有明顯泌鹽表型的二色補血草成熟葉片,構(gòu)建葉片泌鹽轉(zhuǎn)錄組。經(jīng)拼接后與Nr數(shù)據(jù)庫注釋后,利用Dex

14、us方法獲得處理組和對照組之間的差異表達基因5,768個,對泌鹽轉(zhuǎn)錄組的分析顯示92個基因可能參與二色補血草鹽腺泌鹽,包括囊泡運輸基因、各類離子轉(zhuǎn)運載體、ROS清除系統(tǒng)和ABA等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的基因,以及部分轉(zhuǎn)錄因子,經(jīng)17個轉(zhuǎn)錄本的體外qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相關(guān)性較好,而且泌鹽能力增加和減少的突變體同樣驗證了關(guān)鍵的泌鹽基因。除此之外,經(jīng)與鹽腺不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組比較后,共發(fā)現(xiàn)51個基因可能既參與鹽腺的發(fā)育過程,又與鹽腺的

15、泌鹽密切相關(guān),這些鹽腺發(fā)育及泌鹽的基因庫為探索鹽腺發(fā)育及泌鹽的分子機制提供了可靠的背景數(shù)據(jù),為將來確定并驗證鹽腺發(fā)育的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。
　　論文的主要創(chuàng)新點:
　　1.構(gòu)建了二色補血草根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化效率為4.43%,為轉(zhuǎn)基因驗證及確證鹽腺發(fā)育的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。
　　2.發(fā)現(xiàn)二色補血草鹽腺具有獨特的自發(fā)熒光現(xiàn)象,并利用這種方法首次篩選到大量的鹽腺發(fā)育及泌鹽的突變體,并證實二色補血草可以實現(xiàn)

16、自花授粉以保存突變體性狀。
　　3.揭示二色補血草子葉上存在鹽腺,并探討其分化模式,為解釋二色補血草幼苗的早期抗鹽提供了依據(jù)。在個體水平上解釋鹽腺的分布規(guī)律是,隨葉位的不斷增加,單個葉片的鹽腺密度及鹽腺總數(shù)都呈增加的趨勢。
　　4.確定二色補血草第一片真葉上鹽腺的分化劃分為5個明顯的階段:未分化時期、鹽腺分化時期、氣孔分化時期、表皮細胞分化時期和成熟期,鹽腺分化階段具有明顯的時間段,是二色補血草表皮上最早分化成熟的結(jié)構(gòu),比氣