人內(nèi)源性抗菌肽Cathelicidin-LL-37在COPD氣道粘液高分泌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的常見和多發(fā)疾病，當(dāng)前其發(fā)病機(jī)制未明，防治形勢(shì)非常嚴(yán)峻。氣道粘液高分泌是除慢性氣道炎癥和肺氣腫外COPD的又一特征性病理改變，是COPD發(fā)病率和死亡率升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此氣道粘液高分泌的發(fā)生機(jī)制研究，已成為COPD防治領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。多種與COPD發(fā)病密切相關(guān)的因素，如香煙煙霧、病

2、原微生物及其產(chǎn)物（如脂多糖、綠膿菌素），炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞）及炎癥因子（如IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-4）等，可直接或間接作用于氣道上皮細(xì)胞，在氣道粘液高分泌的形成和維持中發(fā)揮重要作用。相關(guān)的機(jī)制研究表明，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在上皮細(xì)胞的粘液分泌過程中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用，而在其下游諸多信號(hào)分子中，MAPK家族成員ERK占據(jù)了非常重要的地

3、位，可形成EGFR-ERK通路。另外，金屬蛋白酶家族的某些成員也參與到粘蛋白MUC5AC（氣道粘液的一種主要大分子成分）的誘導(dǎo)過程中，如細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶(TNF-αconvertingenzyme，TACE)可剪切錨定在胞膜表面的pro-TGF-α，pro-amphiregulin，pro-HB-EGF等前體分子，釋放出可溶性的活性成分TGF-α，amphiregulin(AR)和HB-EGF，這些活性成分作為EGFR的配

4、體與之結(jié)合，通過配體-受體反應(yīng)轉(zhuǎn)激活EGFR及下游信號(hào)通路，促進(jìn)粘蛋白的合成和分泌。在香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(human neutrophil elastase，HNE)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、脂多糖和綠膿菌素、曲霉菌等誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞粘蛋白生成的過程中，TACE介導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活作用已得到證實(shí)。
　　近年來，天然免

5、疫系統(tǒng)在COPD發(fā)病中的作用受到重視。Cathelicidin是人類內(nèi)源性抗菌肽（anti microbial peptides，AMPs）的重要成員，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛表達(dá)于機(jī)體多種組織。Cathelicidin具有多種生物學(xué)功能，除具有針對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等的抗微生物活性外，還在炎癥/免疫反應(yīng)、損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖和凋亡等病理生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。人們注意到，Cathelicidin的調(diào)控活性與COPD發(fā)病的多

6、個(gè)病理環(huán)節(jié)有較好的契合，推測(cè)Cathelicidin可能在COPD的發(fā)病中占有一定地位。相關(guān)研究表明，COPD患者誘導(dǎo)痰、肺組織、支氣管肺泡灌洗液以及呼吸道上皮襯液中LL-37(Cathelicidin發(fā)揮作用的活性片段)的表達(dá)均顯著升高，提示LL-37與COPD的發(fā)病密切相關(guān);我們的前期研究則發(fā)現(xiàn)，LL-37能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞凋亡并伴隨IL-8、TNF-α等炎癥因子的釋放，提示LL-37可能在COPD發(fā)病的氣道炎癥和肺氣

7、腫形成兩個(gè)病理過程中發(fā)揮作用。然而，對(duì)于COPD的氣道粘液高分泌過程，LL-37是否在其中發(fā)揮作用尚不得而知。有文獻(xiàn)報(bào)道，LL-37可通過轉(zhuǎn)激活EGFR-ERK信號(hào)通路，活化氣道上皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子IL-8的釋放;LL-37還可通過MAPK途徑上調(diào)人結(jié)腸上皮細(xì)胞粘蛋白基因的表達(dá)，增加粘蛋白合成。根據(jù)LL-37在COPD患者氣道內(nèi)的高表達(dá)狀態(tài)以及LL-37激活相關(guān)信號(hào)通路的能力，我們提出假設(shè)，推測(cè)氣道局部高水平的LL-37能夠促進(jìn)氣道粘

8、蛋白的生成，從而參與氣道粘液高分泌狀態(tài)的形成，并因此在COPD的發(fā)病及病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
　　為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究在人體標(biāo)本和體外細(xì)胞兩個(gè)層面探討了LL-37對(duì)COPD氣道粘液分泌的影響及其可能的分子機(jī)制。
　　目的：
　　觀察COPD患者小氣道局部?jī)?nèi)源性抗菌肽Cathelicidin/LL-37和粘蛋白的表達(dá)情況，探討Cathelicidin/LL-37對(duì)人氣道上皮細(xì)胞粘蛋白MUC5AC的體外誘導(dǎo)效應(yīng)及相關(guān)分

9、子機(jī)制，初步闡明Cathelicidin/LL-37在COPD氣道粘液高分泌中的作用。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象和一般資料收集
　　選取因肺外周腫瘤需行肺葉切除術(shù)的穩(wěn)定期COPD患者15例(COPDgroup)、肺功能正常的吸煙者15例(NormalSmokergroup，NSgroup)和肺功能正常的不吸煙者15例(NormalNon-smokinggroup，NNgroup)，術(shù)前收集性別、年齡、吸煙史等一般資

10、料，并行常規(guī)肺通氣功能檢查，記錄一秒量(forcedexpiratoryvolumein1sec，F(xiàn)EV1)和一秒率(FEV1/forcedvolumecapacity,FEV1/FVC)。COPD診斷的確立根據(jù)GOLD(2010)標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.人體組織病理研究
　　術(shù)中收集手術(shù)切除的外周肺組織，距腫瘤邊緣5cm以上，以排除腫瘤的影響。對(duì)肺組織切片進(jìn)行HE染色、糖原過碘酸雪夫(PeriodicAcid-Schiffstai

11、n，PAS)染色和免疫組織化學(xué)染色，比較3組標(biāo)本的形態(tài)學(xué)特征以及外周小氣道上皮LL-37和粘蛋白MUC5AC的表達(dá)情況，分析LL-37、粘蛋白MUC5AC與肺通氣功能指標(biāo)，以及LL-37與粘蛋白MUC5AC之間的相關(guān)性。
　　3.體外研究
　　3.1體外培養(yǎng)人支氣管上皮NCI-H292細(xì)胞，香煙提取物(cigarettesmokeextract，CSE)和LL-37合成肽分別以不同刺激濃度、不同刺激時(shí)間作用于細(xì)胞，MTT法檢

12、測(cè)CSE和LL-37合成肽對(duì)細(xì)胞活力的影響，選取細(xì)胞活力不低于80％的刺激模式為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考范圍。
　　3.2LL-37合成肽以連續(xù)濃度梯度和時(shí)間梯度刺激NCI-H292細(xì)胞，收集培養(yǎng)液上清和細(xì)胞裂解物，用ELISA分別檢測(cè)其中粘蛋白MUC5AC含量，同時(shí)BCA法檢測(cè)細(xì)胞裂解物中總蛋白含量。粘蛋白MUC5AC總量計(jì)算公式為:（上清中MUC5AC含量十細(xì)胞裂解物中MUC5AC含量）/細(xì)胞總蛋白含量。為比對(duì)LL-37作用的特異性，

13、亂碼LL-37（scrambleLL-37，sLL-37）合成肽以相同的作用模式刺激細(xì)胞，檢測(cè)粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　3.3在培養(yǎng)體系中有CSE（0.005cig/ml）存在的情況下，LL-37合成肽和sLL-37合成肽分別以連續(xù)濃度梯度和時(shí)間梯度刺激NCI-H292細(xì)胞，ELISA檢測(cè)細(xì)胞粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　3.4在培養(yǎng)體系中有和無CSE(0.005cig/ml)存在的情況下，LL-37合成肽以

14、連續(xù)濃度梯度和時(shí)間梯度刺激NCI-H292細(xì)胞，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-8的水平;以重組人IL-8單獨(dú)刺激NCI-H292細(xì)胞，或經(jīng)IL-8中和抗體預(yù)處理細(xì)胞后再給予LL-37合成肽刺激，ELISA檢測(cè)粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　3.4CSE以不同作用濃度刺激NCI-H292細(xì)胞，免疫熒光染色后激光共聚焦掃描檢測(cè)LL-37在細(xì)胞中的表達(dá)范圍和強(qiáng)度，同時(shí)ELISA檢測(cè)上清液中LL-37的含量。
　　3.5LL-3

15、7合成肽以連續(xù)濃度梯度和時(shí)間梯度刺激NCI-H292細(xì)胞，收集上清和細(xì)胞裂解物，ELISA檢測(cè)上清中TGF-α的含量，Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞裂解物中ERK、EGFR的磷酸化水平，熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）檢測(cè)細(xì)胞的TACE活性。
　　3.6用TACE抑制劑TAPI-1，EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478，ERK上游MEK分子的抑制劑

16、U0126，以及TGF-α中和抗體、EGFR中和抗體、AR中和抗體和HB-EGF中和抗體等預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞后，再給予LL-37合成肽刺激，檢測(cè)步驟3.5中相應(yīng)的指標(biāo)。
　　3.7LL-37合成肽刺激NCI-H292細(xì)胞后，利用熒光探針DCF-DA檢測(cè)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;用抗氧化劑DMTU和nPG預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞后再給予LL-37合成肽刺激，F(xiàn)RET檢測(cè)細(xì)胞TACE活性，ELISA檢測(cè)粘蛋白MUC5AC總的

17、生成量。
　　3.8用蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)抑制劑Staurosporine預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞后再給予LL-37合成肽刺激，F(xiàn)RET檢測(cè)細(xì)胞TACE活性，ELISA檢測(cè)粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　結(jié)果：
　　1.一般資料比較
　　3組研究對(duì)象在年齡和性別比例上無顯著性差異（均P＞0.05），COPD組的FEV1％較肺功能正常吸煙組和肺功能正常不吸煙組明顯降低（均P＜0.

18、05），肺功能正常吸煙組和COPD組的吸煙史（吸煙指數(shù)）無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.人體組織病理學(xué)研究
　　HE染色結(jié)果顯示，COPD組小氣道局部炎癥征象比較明顯，上皮完整性破壞;肺功能正常不吸煙組小氣道無明顯炎癥征象，上皮保持完整;肺功能正常吸煙組小氣道的形態(tài)特征介于前兩組之間。
　　糖原PAS染色結(jié)果顯示，COPD組小氣道上皮染色非常明顯，杯狀細(xì)胞數(shù)明顯增多;肺功能正常不吸煙組小氣道上皮未見明顯染色，杯

19、狀細(xì)胞數(shù)很少;肺功能正常吸煙組小氣道上皮也有較明顯染色，杯狀細(xì)胞數(shù)增多，但少于COPD組。PAS染色面積百分比在COPD組最高，肺功能正常不吸煙組最低，肺功能正常吸煙組介于前兩組之間(均P＜0.05)。
　　免疫組化染色結(jié)果顯示，LL-37和MUC5AC的著色部位主要位于COPD患者外周小氣道上皮內(nèi)，其中LL-37分布廣泛，位于纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)，而粘蛋白MUC5AC分布較單一，主要位于杯狀細(xì)胞內(nèi)。LL-37和粘蛋白M

20、UC5AC染色強(qiáng)度的變化趨勢(shì)相似，都是在COPD組最高，肺功能正常不吸煙組最低，肺功能正常吸煙組介于兩組之間(均P＜0.05)。
　　相關(guān)性分析表明，小氣道上皮中LL-37和粘蛋白MUC5AC的表達(dá)均與肺功能指標(biāo)FEV1％呈顯著負(fù)相關(guān)（分別有r=-0.606，P＜0.01;r=-0.641，P＜0.01），而LL-37與粘蛋白MUC5AC呈顯著正相關(guān)（r=0.776，P＜0.01）。
　　3.體外研究
　　3.1.細(xì)胞

21、活力的MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，LL-37合成肽在0-10μg/ml的濃度范圍內(nèi)刺激細(xì)胞24h，NCI-H292細(xì)胞活力不低于80％;CSE在0-0.015cig/ml的濃度范圍內(nèi)刺激細(xì)胞24h，NCI-H292細(xì)胞活力不低于80％。
　　3.2.LL-37合成肽單獨(dú)刺激NCI-H292細(xì)胞可誘導(dǎo)粘蛋白MUC5AC的生成，并呈明顯的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系（均P＜0.05）;在CSE(0.005cig/ml)存在的情況下，LL-37合

22、成肽能以同樣的作用模式誘導(dǎo)粘蛋白MUC5AC的生成，且誘導(dǎo)效應(yīng)較LL-37合成肽單獨(dú)刺激時(shí)更強(qiáng)（均P＜0.05）。sLL-37合成肽對(duì)NCI-H292細(xì)胞粘蛋白MUC5AC的生成無明顯影響(P＞0.05)。
　　3.3.LL-37合成肽單獨(dú)刺激NCI-H292細(xì)胞可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞釋放IL-8，并呈明顯的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系（均P＜0.05）;在CSE(0.005cig/ml)存在的情況下，LL-37合成肽能以同樣的

23、作用模式誘導(dǎo)IL-8的釋放，且誘導(dǎo)效應(yīng)較LL-37合成肽單獨(dú)刺激時(shí)更強(qiáng)（均P＜0.05）;重組人IL-8可刺激NCI-H292細(xì)胞生成粘蛋白MUC5AC，而IL-8中和抗體預(yù)處理細(xì)胞可顯著抑制LL-37合成肽誘導(dǎo)的粘蛋白MUC5AC生成（均P＜0.05）。
　　3.4.CSE刺激可誘導(dǎo)氣道上皮NCI-H292細(xì)胞LL-37表達(dá)上調(diào)。激光共聚焦掃描圖像顯示，經(jīng)CSE刺激后細(xì)胞中LL-37呈強(qiáng)陽性表達(dá);ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)CSE刺激

24、后培養(yǎng)液上清中LL-37含量也明顯增加，且這種增加依賴于CSE的刺激濃度（均P＜0.05）。
　　3.5.LL-37合成肽可誘導(dǎo)ERK和EGFR磷酸化。當(dāng)刺激時(shí)間為15min時(shí)，ERK的磷酸化達(dá)到峰值水平，在這一時(shí)間點(diǎn)，LL-37對(duì)ERK和EGFR磷酸化的誘導(dǎo)呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478可抑制LL-37合成肽誘導(dǎo)的EGFR、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成（均P＜0.05）;EGFR中和抗體

25、(Ab-3)和ERK抑制劑U0126可抑制LL-37合成肽誘導(dǎo)的ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成（均P＜0.05）;AR中和抗體和HB-EGF中和抗體對(duì)LL-37合成肽誘導(dǎo)的EGFR磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成無明顯影響（均P＞0.05）。
　　3.6.LL-37合成肽可濃度和時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞TACE活化，酶活性的非線性擬合結(jié)果表明，細(xì)胞TACE活性在刺激6h時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.05)，其后直至2

26、4h，大致保持穩(wěn)定（均P＞0.05）。在刺激粘蛋白MUC5AC生成的同時(shí)，LL-37合成肽還能同步誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-α，且也呈明顯的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系（均P＜0.05）。TACE選擇性抑制劑TAPI-1可抑制LL-37合成肽誘導(dǎo)的TGF-α釋放、EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的產(chǎn)生（均P＜0.05）;TGF-α中和抗體和EGFR中和抗體可抑制LL-37合成肽誘導(dǎo)的EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋

27、白MUC5AC的產(chǎn)生（均P＜0.05）;EGFR中和抗體可增加LL-37誘導(dǎo)的TGF-α水平(P＜0.05)。
　　3.7.LL-37合成肽對(duì)NCI-H292細(xì)胞內(nèi)ROS水平無明顯影響(P＞0.05);抗氧化劑DMTU和nPG對(duì)LL-37合成肽誘導(dǎo)的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成無明顯影響（均P＞0.05）;PKC抑制劑Stauropsorine對(duì)LL-37合成肽誘導(dǎo)的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成也無明顯影響（均

28、P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.COPD患者外周小氣道上皮中Cathelicidin/LL-37和粘蛋白MUC5AC均呈高表達(dá)狀態(tài)，且二者密切相關(guān);
　　2.Cathelicidin/LL-37可誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞粘蛋白MUC5AC的產(chǎn)生，在香煙煙霧作用下，這種誘導(dǎo)效應(yīng)更強(qiáng);
　　3.Cathelicidin/LL-37誘導(dǎo)粘蛋白MUC5AC生成的機(jī)制可能涉及TACE-TGF-α-EGFR-ERK信號(hào)通路的