內源性抗菌肽Cathelicidins在慢性阻塞性肺疾病病理改變中作用的研究.pdf

1、研究背景
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，因其患病率和死亡率高，造成沉重的社會經濟負擔，已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題。COPD是一種以氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，小氣道重塑和肺氣腫是引起氣流受限的主要原因，探討其形成機制，對于有效控制COPD病情進展，具有重要的意義。
　　抗菌肽（antimicrobialpep

2、tides，AMPs）是在動物防御系統(tǒng)中發(fā)現的一種多肽，由宿主基因編碼，在天然免疫中發(fā)揮重要作用。AMPs主要分為兩大家族:Cathelicidins家族和防御素家族。hCAP18/LL-37（以下簡稱LL-37）是人體Cathelicidins家族的唯一成員，既往的研究多集中于其抗菌作用，近年來的研究表明，LL-37在炎癥反應、損傷修復、細胞增殖和凋亡等多種病理生理過程中也發(fā)揮重要作用。
　　我們的前期研究顯示，COPD穩(wěn)定期患

3、者誘導痰中LL-37的表達較非COPD對照組顯著增高，且LL-37的表達與誘導痰中炎癥指標IL-8水平呈顯著正相關，與患者第一秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1％)呈顯著負相關;進一步研究發(fā)現，COPD患者肺組織LL-37的表達顯著高于非COPD對照組，LL-37主要表達于小氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞、炎性細胞（中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞）和成纖維細胞中。這些研究結果表明，異常高表達的LL-37可能參與了COPD的病理過程。

4、r>　　分析我們的前期研究結果可見，LL-37在COPD吸煙組患者肺組織小氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞中的表達顯著高于吸煙對照組，而不吸煙對照組患者小氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞中LL-37的表達顯著低于前兩者?；谏鲜鲅芯勘尘?，我們提出以下問題:①COPD患者肺組織小氣道和肺泡上皮細胞異常高表達的LL-37是否與小氣道重塑和肺氣腫的病理改變有關？②吸煙是否為誘導肺組織LL-37表達增高的重要因素？③COPD小氣道上皮細胞高表達的LL-37

5、怎樣影響其周圍的膠原沉積和組織重塑？④LL-37在小氣道區(qū)和肺泡區(qū)均高表達，但卻出現膠原過度沉積的小氣道重塑和極少膠原沉積的肺氣腫兩種不同的病理改變，其原因是什么？
　　為了回答上述問題，我們進行了本課題的設計和研究。
　　目的
　　探討內源性抗菌肽Cathelicidins在COPD小氣道重塑和肺氣腫病理改變中的作用及相關機制。
　　方法
　　1.觀察COPD患者肺組織Cathelicidin(LL-37

6、)的表達，分析其與COPD小氣道重塑和肺氣腫病理改變的關系。
　　(1)研究對象及臨床資料收集:
　　選擇因肺外周腫瘤行肺葉切除術的患者60例，其中穩(wěn)定期COPD吸煙患者（COPD吸煙組）18例，肺功能正常的吸煙患者（吸煙對照組）22例，肺功能正常的不吸煙患者（不吸煙對照組）20例。術前收集性別、年齡和吸煙史等一般資料，并行肺功能檢查，COPD的診斷按照慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GlobalInitiativeforChro

7、nicObstructiveLungDisease,GOLD)標準。
　　(2)人體肺組織標本:
　?、貶E染色測量小氣道壁厚度、平均內襯間隔(meanlinearintercept,MLI)和平均肺泡數(meanalveolarnumber,MAN)，天狼猩紅染色檢測肺組織膠原沉積面積;
　?、诿庖呓M織化學染色法檢測肺組織中LL-37的表達;
　?、鄯治鲂獾绤^(qū)LL-37的表達與小氣道壁厚度、膠原沉積面積的相關

8、性，以及肺泡上皮細胞LL-37的表達與MLI、MAN的相關性。
　　2.煙熏法建立大鼠COPD模型，研究香煙煙氣對大鼠肺組織Cathelicidin(rCRAMP)表達的影響，并分析Cathelicidin(rCRAMP)與大鼠小氣道重塑和肺氣腫病理改變的關系。
　　雄性Wistar大鼠72只，隨機分為煙熏組和空白對照組，每組根據造模時間分為1月組、3月組和6月組，每組各12只。煙熏組大鼠每日置于煙氣染毒柜中被動吸煙（南方牌

9、香煙，焦油量:14mg，煙氣煙堿量:1mg）兩次，每次10支香煙持續(xù)30min，兩次間隔時間不低于6小時?？瞻讓φ战M大鼠不做特殊處理。造模過程中每隔2周對大鼠逐只稱重，記錄大鼠體重變化。各組大鼠造模結束后，對以下指標進行檢測:
　　(1)小動物肺功能儀檢測氣道阻力(RL)、肺動態(tài)順應性(Cdyn)和潮氣量(VT);
　　(2)HE染色形態(tài)學測量小氣道壁厚度、MLI和MAN，天狼猩紅染色檢測小氣道區(qū)膠原沉積面積;
　　(

10、3)免疫組織化學染色法檢測各組大鼠肺組織rCRAMP的表達;
　　(4)分析大鼠肺組織小氣道區(qū)rCRMP的表達與小氣道壁厚度、膠原沉積的相關性，以及肺泡上皮細胞rCRAMP的表達與MLI、MAN的相關性。
　　3.建立人支氣管上皮細胞與肺成纖維細胞共培養(yǎng)模型，研究支氣管上皮細胞分泌的LL-37對肺成纖維細胞膠原表達的影響，并對其信號傳導通路進行探討。
　　(1)培養(yǎng)人支氣管上皮細胞(16HBE)，用不同濃度的香煙提取物

11、(CSE)刺激后，免疫熒光染色法檢測細胞中LL-37的表達。
　　(2)16HBE細胞與人肺成纖維細胞(HFL-1)在Transwell六孔板中共培養(yǎng)，給予不同濃度的CSE刺激后，ELISA法檢測細胞上清液中LL-37的表達，Sircol法測定細胞上清液中膠原的表達。
　　(3)HFL-1細胞在Transwell六孔板下層培養(yǎng)，給予與步驟2相同濃度的CSE刺激后，Sircol法測定細胞上清中膠原的表達。
　　(4)不同

12、濃度的LL-37合成肽、TGF-β1、亂碼LL-37合成肽(sLL-37)刺激HFL-1細胞48h后，Sircol法檢測細胞上清液中膠原的表達。
　　(5)不同濃度的LL-37合成肽刺激HFL-1細胞48h后，RT-PCR法檢測細胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的表達。
　　(6)分別用甲酰肽樣受體（formylpeptidereceptorlike1，FPRL-1）拮抗劑WRW4、ERK阻斷劑PD98059、JNK阻斷劑SP60012

13、5、p38MAPK阻斷劑SB203580、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）阻斷劑LY294002預處理HFL-1細胞2h后，再給予LL-37合成肽刺激48h，Sircol法測定細胞上清中膠原的表達。
　　(7)不同濃度的LL-37合成肽刺激HFL-1細胞不同時間，Westernblot方法檢測細胞裂解物中ERK和磷酸化ERK(pERK)的表達。
　　(8)分別給予FPRL

14、-1受體拮抗劑WRW4、ERK阻斷劑PD98059預處理HFL-1細胞2h后再給予LL-37刺激，Westernblot方法檢測細胞裂解物中ERK和pERK的表達。
　　4.檢測COPD吸煙組、吸煙對照組和不吸煙對照組患者肺組織小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細胞表面標記蛋白，比較不同區(qū)域成纖維細胞細胞外基質蛋白的表達情況，探討COPD患者肺組織成纖維細胞的異質性。
　　(1)采用免疫組織化學雙染的方法檢測肺組織成纖維細胞波形蛋白(v

15、imentin)、E-鈣粘素(E-cadherin)、CD45的表達，分析小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細胞的表型，并計算每種表型成纖維細胞所占的比例;
　　(2)用免疫組織化學染色法對小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、彈力蛋白、纖維連接蛋白的表達進行檢測。
　　結果
　　1.(1)COPD吸煙組與肺功能正常的對照組患者在年齡上無統(tǒng)計學差異，COPD吸煙組與吸煙對照組患者吸煙指數無顯著差異。COPD吸煙組患者FEV

16、1％與FEV1/FVC均顯著低于肺功能正常的對照組(P＜0.01，P＜0.01)。
　　(2)與對照組相比，COPD吸煙組患者小氣道壁厚度顯著增加，MLI顯著增加，MAN顯著降低(P＜0.01)。而上述指標在吸煙對照組和不吸煙對照組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　(3)COPD吸煙組患者小氣道區(qū)膠原沉積面積較對照組顯著增多(P＜0.01)，而肺泡區(qū)膠原的表達顯著低于對照組(P＜0.01)。
　　(4)免疫組化染

17、色結果顯示，LL-37主要表達于肺組織小氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞、炎癥細胞（包括中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞）和成纖維細胞。不吸煙對照組患者肺組織LL-37呈弱陽性表達，COPD吸煙組患者肺組織小氣道區(qū)和肺泡區(qū)LL-37的表達顯著高于吸煙對照組(P＜0.01，P＜0.01)，吸煙對照組患者小氣道區(qū)和肺泡區(qū)LL-37的表達顯著高于不吸煙對照組(P＜0.01，P＜0.01)。
　　(5)小氣道上皮細胞LL-37的平均光密度與小氣道

18、壁厚度和膠原沉積面積顯著正相關(r=0.62，P＜0.01;r=0.73，P＜0.01);小氣道粘膜下層LL-37陽性細胞數與小氣道壁厚度和膠原沉積面積顯著正相關(r=0.65，P＜0.01;r=0.71，P＜0.01);肺泡上皮細胞LL-37的表達與MLI顯著正相關(r=0.64，P＜0.01)，與MAN顯著負相關(r=-0.54，P＜0.01)。
　　2.(1)煙熏大鼠體重增長較正常大鼠明顯延緩，煙熏6周后大鼠體重與空白對照組

19、相比差異顯著(P＜0.01)。
　　(2)與空白對照組相比，煙熏1月組大鼠RL和Cdyn均未出現明顯改變(P＞0.05)，煙熏3月組與煙熏6月組大鼠RL分別增加13.5％和21.9％，Cdyn分別下降18.1％和23.8％。煙熏組大鼠潮氣量與空白對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　(3)煙熏3個月后，大鼠出現小氣道重塑及肺氣腫的病理改變，表現為小氣道壁增厚，小氣道壁周圍膠原沉積面積增加，肺泡間隔破壞，肺泡腔擴大，煙熏

20、6個月后上述病理改變更加明顯。形態(tài)學測量結果顯示:煙熏3個月后，大鼠小氣道壁厚度和膠原沉積面積較對照組顯著增加，且煙熏6月組顯著高于煙熏3月組。煙熏3個月后大鼠MLI顯著增高，MAN顯著降低。與空白對照組相比，煙熏6月組大鼠MLI增加70.7％，MAN下降48.9％。煙熏1月組大鼠小氣道壁厚度、膠原沉積面積、MLI和MAN較空白對照組無顯著差異（P均＞0.05）。
　　(4)煙熏1個月后大鼠小氣道區(qū)和肺泡區(qū)rCRAMP的表達顯著高

21、于空白對照組，且隨煙熏造模時間的延長，rCRAMP的表達逐漸增加(P＜0.01)。
　　(5)大鼠小氣道區(qū)rCRAMP平均光密度與小氣道壁厚度顯著正相關(r=0.49，P＜0.01)，與氣道壁周圍膠原沉積面積顯著正相關(r=0.50，P＜0.01);肺泡上皮細胞rCRAMP平均光密度與MLI呈顯著正相關(r=0.45，P＜0.01)，與MAN呈顯著負相關(r=-0.49，P＜0.01)。
　　3.(1)細胞免疫熒光染色結果顯

22、示CSE刺激后，16HBE細胞中LL-37的表達顯著增強。
　　(2)CSE刺激后，16HBE/HFL-1共培養(yǎng)體系中LL-37的濃度增加，膠原的表達也增加，且LL-37中和抗體顯著降低膠原的表達(P＜0.05)。
　　(3)CSE刺激后，HFL-1細胞上清液中膠原的表達無明顯改變(P＞0.05)。
　　(4)LL-37合成肽可促進HFL-1細胞膠原的分泌，呈明顯的濃度-效應關系。TGF-β1顯著誘導膠原的產生，其誘導

23、效應較LL-37合成肽更強。sLL-37合成肽對HFL-1細胞膠原的產生無明顯影響(P＞0.05)。
　　(5)LL-37合成肽上調HFL-1細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA水平，呈劑量-效應關系。
　　(6)FPRL-1拮抗劑WRW4預處理后，與LL-37合成肽刺激組相比，膠原的分泌顯著下降，且與WRW4呈濃度依賴性。
　　(7)MAPK阻斷劑和PI3K阻斷劑預處理后，只有ERK阻斷劑PD98059能顯著抑制膠原的分泌

24、(P＜0.05)，其他通路抑制劑對膠原分泌無顯著影響(P＞0.05)。
　　(8)LL-37合成肽可誘導ERK磷酸化，在作用30min時，磷酸化最明顯，且LL-37合成肽對ERK磷酸化的誘導呈濃度依賴性;WRW4和PD98059可抑制LL-37合成肽誘導的ERK磷酸化。
　　4.(1)在不吸煙對照組和吸煙對照組患者的肺組織中只觀察到一種表型的成纖維細胞(vimentln+CD45-E-cadherin-)，即肺組織來源的成纖

25、維細胞;在COPD吸煙組患者的肺組織小氣道區(qū)僅觀察到vimentin+CD45-E-cadherin-表型的成纖維細胞，而在肺泡區(qū)卻觀察到三種表型的成纖維細胞:vimentin+E-cadherin+、vimentin+CD45+、vimentin+CD45-E-cadherin-，即上皮間質轉化來源、循環(huán)纖維細胞來源和肺組織來源的成纖維細胞。其中vimentin+E-cadherin+表型的成纖維細胞約占24.3％，vlmentin+

26、CD45+表型的成纖維細胞約占12.4％，而大約63.3％的成纖維細胞來源于肺組織。
　　(2)與不吸煙對照組和吸煙對照組相比，COPD吸煙組患者小氣道區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原、彈力蛋白、纖維連接蛋白的表達顯著增高（P均＜0.01），而肺泡區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原、彈力蛋白、纖維連接蛋白的表達顯著降低（P均＜0.01）。
　　結論
　　1.COPD患者肺組織異常增高的Cathelicidin（LL-37）與小氣道重塑和肺氣腫的病理改變顯著

27、相關。
　　2.香煙煙氣是誘導大鼠肺組織Cathelicidin(rCRAMP)表達增高的原因，rCRAMP與大鼠小氣道重塑與肺氣腫的病理改變密切相關。
　　3.CSE誘導支氣管上皮細胞分泌的Cathelicidin(LL-37)可通過結合上皮下肺成纖維細胞表面的FPRL-1受體并激活ERK信號通路促進膠原表達，從而參與小氣道重塑的病理過程。
　　4.COPD患者肺組織小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細胞存在明顯的異質性;不同區(qū)