人抗菌肽LL-37的原核表達(dá)及其抗小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA感染活性的初步研究.pdf

1、LL-37是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽Cathelicidin家族的唯一成員,由37個(gè)氨基酸殘基組成,因其N端前兩個(gè)氨基酸殘基為亮氨酸(L)而得名。LL-37抗菌譜廣,體外研究顯示對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、病毒均發(fā)揮抑制作用,特別是對(duì)部分臨床耐藥菌及臨床易感菌株也有較強(qiáng)的抑菌活性,因此有很好的應(yīng)用前景。本文采用原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)小分子抗菌多肽LL-37的可溶表達(dá),并研究其在皮膚創(chuàng)傷感染中發(fā)揮的活性作用。本課題將LL-37連接入pET32

2、a載體中進(jìn)行可溶表達(dá),通過考察表達(dá)誘導(dǎo)因素獲得高產(chǎn)量的LL-37,體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其抗菌活性,最后研究LL-37對(duì)于小鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染的預(yù)防治療作用,并從抗細(xì)菌生物膜方面探討其作用機(jī)制。
　　研究目的:
　　本文主要是采用pET32a表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)LL-37的可溶表達(dá),同時(shí)還探討了LL-37對(duì)于小鼠深Ⅱ度燙傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)創(chuàng)傷感染模型的預(yù)防治療作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步研

3、究,為小分子抗菌肽的基因工程表達(dá)提供參考,也為L(zhǎng)L-37的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.融合蛋白Trx-LL-37的生物信息學(xué)分析及表達(dá)載體構(gòu)建:運(yùn)用相關(guān)生物信息學(xué)軟件對(duì)融合蛋白Trx-LL-37氨基酸序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè),初步了解融合蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及可溶表達(dá)概率。參考GenBank中已發(fā)表的LL-37全長(zhǎng)cDNA基因序列(No.:CAA46115)以及 pET32a(+)多克

4、隆位點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)兩條特異性引物,PCR擴(kuò)增出含有LL-37成熟肽的基因序列,引入KpnⅠ、SacⅠ酶切位點(diǎn)以及甲酸裂解位點(diǎn)。通過KpnⅠ、SacⅠ雙酶切反應(yīng),將含有LL-37的小片段連接入pET32a表達(dá)載體中,進(jìn)行菌落PCR、雙酶切以及質(zhì)粒測(cè)序鑒定。
　　2.LL-37的原核表達(dá)、純化及鑒定:將構(gòu)建好的表達(dá)載體pET32a-LL-37轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),采用SDS-PAGE、WesternBlot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒

5、定。以融合蛋白Trx-LL-37的可溶蛋白表達(dá)水平為指標(biāo),通過誘導(dǎo)條件及表達(dá)條件的單因素優(yōu)化,確定最佳表達(dá)參數(shù)。通過Ni2+親和層析色譜法純化融合蛋白Trx-LL-37,甲酸裂解去除標(biāo)簽蛋白,再次采用Ni2+親和層析色譜法純化目標(biāo)蛋白LL-37。
　　3.LL-37抗小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA創(chuàng)傷感染活性初步研究:選取金黃色葡萄球菌S.aureus、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌S.epidermidis、大腸桿菌E.

6、coli、銅綠假單胞菌P.aeruginosa、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等臨床常見感染菌種作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法及微量肉湯稀釋法,驗(yàn)證純化產(chǎn)物L(fēng)L-37的抑菌活性。建立小鼠深Ⅱ度燙傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷感染模型,以生理鹽水為陰性對(duì)照、慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照,通過統(tǒng)計(jì)分析體重變化、組織菌負(fù)荷、感染愈合時(shí)間、創(chuàng)面愈合率等指標(biāo)探討了LL-37的治療效果。
　　4.LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究:采過96

7、孔板法,以金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性菌對(duì)照,探討了MRSA的體外成膜能力。然后結(jié)合激光共聚焦實(shí)驗(yàn)研究了LL-37對(duì)MRSA生物膜形成的影響以及對(duì)已形成的MRSA生物膜的破壞作用。
　　結(jié)果:
　　1.融合蛋白Trx-LL-37生物信息學(xué)分析及表達(dá)載體構(gòu)建:經(jīng)過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析,融合蛋白Trx-LL-37基因編碼蛋白含有195個(gè)氨基酸,分子量為21.5kDa,理論等電點(diǎn)為6.3,熱穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng),屬于穩(wěn)定類蛋白;融合蛋白

8、二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,主要包含α-螺旋、無規(guī)則卷曲;根據(jù)兩個(gè)參數(shù)模型預(yù)測(cè)顯示,重組融合蛋白具有可溶性表達(dá)的傾向,可采用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)。特異性引物PCR擴(kuò)增出含有LL-37成熟肽的基因序列,引入特異性酶切位點(diǎn)以及甲酸裂解位點(diǎn)。經(jīng)KpnⅠ、SacⅠ雙酶切后連接入pET32a表達(dá)載體,進(jìn)行菌落PCR、雙酶切以及質(zhì)粒測(cè)序鑒定,片段大小以及氨基酸序列均與GeneBank公布一致。
　　2.LL-37的原核表達(dá)、純化及鑒定:構(gòu)建的表達(dá)菌BL21

9、(DE3)/pET32a-LL-37經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE、WesternBlot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物鑒定結(jié)果顯示,IPTG誘導(dǎo)后的菌體蛋白在21.5kDa附近存在目標(biāo)蛋白(Trx-LL-37)條帶,而未誘導(dǎo)的未出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶。誘導(dǎo)表達(dá)條件經(jīng)過優(yōu)化,種子菌180rpm37℃培養(yǎng)2.5h,加入終濃度0.05mMIPTG,于17℃低溫誘導(dǎo),培養(yǎng)24h,此時(shí)融合蛋白Trx-LL-37表達(dá)量最高,重組蛋白在總可溶蛋白中的比例也最高,達(dá)到45％以

10、上。融合蛋白Trx-LL-37經(jīng)Ni2+親和層析色譜法一次純化,甲酸裂解去除標(biāo)簽蛋白,Ni2+親和層析色譜法二次純化,最終獲得目標(biāo)蛋白LL-37。終產(chǎn)量為每升發(fā)酵液得到目標(biāo)蛋白LL-37約3mg。經(jīng)RP-HPLC色譜分析,峰面積結(jié)果顯示,目標(biāo)蛋白純度在90%以上。
　　3.LL-37抗小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA創(chuàng)傷感染活性初步研究:瓊脂孔穴擴(kuò)散法及微量肉湯稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,產(chǎn)物 LL-37對(duì)于臨床常見感染菌種具有抑菌活性,并且其 M

11、ICs以及 MBCs與經(jīng)典文獻(xiàn)一致。本實(shí)驗(yàn)建立小鼠深Ⅱ度燙傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷感染模型,觀察 LL-37對(duì)創(chuàng)面感染的影響,以生理鹽水為陰性對(duì)照、慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照,進(jìn)行比較。每日觀察發(fā)現(xiàn),治療組小鼠精神狀態(tài)正常,進(jìn)食、休息等活動(dòng)均未受到影響,體重正常增長(zhǎng);生理鹽水組小鼠精神萎靡,毛發(fā)無光澤,體重水平一直處于治療組小鼠之下。具體結(jié)果顯示, LL-37組第3d創(chuàng)面即干燥結(jié)痂,痂下濕潤(rùn),滲出物相比對(duì)照組明顯減少,局部組織菌負(fù)荷比對(duì)照

12、組低了約3.5-Log(CEU/gtissue),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明LL-37有效降低了局部組織菌負(fù)荷,能夠及時(shí)抑制早期燙傷創(chuàng)面細(xì)菌的定植與增長(zhǎng),預(yù)防控制感染的發(fā)展。第9d,LL-37組創(chuàng)面明顯縮小,痂下肉芽組織生長(zhǎng)迅速,愈合率與慶大霉素組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。9dHE病理切片還發(fā)現(xiàn),生理鹽水組創(chuàng)面正下方皮下組織分布有膿細(xì)胞碎片,可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),而治療組均無;除此,LL-37皮下出現(xiàn)大量成纖維母細(xì)胞及新生血

13、管,修復(fù)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照組。從另一方面說明,LL-37對(duì)模型小鼠燙傷創(chuàng)面具有促愈合修復(fù)作用。綜上, LL-37對(duì)小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA感染創(chuàng)傷模型具有一定效果。
　　4. LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究:96孔板法聯(lián)合結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示,MRSA與陽(yáng)性質(zhì)控菌株S.aureus(ATCC25923)相比,兩者成膜能力相當(dāng),在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著差異(P>0.05)。然后,本實(shí)驗(yàn)選取6.25、3.13、0.625、0.0625μ

14、M4個(gè)亞抑菌濃度,研究LL-37對(duì)于MRSA體外生物膜形成的影響,發(fā)現(xiàn)LL-37不僅作用于生物膜形成的初始階段——細(xì)菌的附著,還對(duì)已成型的生物膜具有殺傷破壞作用。結(jié)果顯示,LL-37在1/20MIC濃度對(duì)生物膜形成的抑制作用即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,1/4 MIC3.13μM條件下對(duì)生物膜形成的抑制率達(dá)63%;在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到,1/4MICLL-37作用48h后,MRSA生物膜內(nèi)組成細(xì)菌數(shù)目明顯減少,成形的菌斑結(jié)構(gòu)疏松,無信號(hào)區(qū)居多,

15、生物膜較薄,平均厚度僅為未加藥組的1/4。
　　結(jié)論:
　　本研究通過原核系統(tǒng)可溶表達(dá)得到融合蛋白Trx-LL-37;融合蛋白經(jīng)甲酸裂解、兩步Ni柱純化獲得目標(biāo)蛋白LL-37,體外抑菌試驗(yàn)證明其具有抑菌活性。通過對(duì)小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA感染創(chuàng)面治療發(fā)現(xiàn),LL-37能夠抑制感染創(chuàng)面細(xì)菌的定植與生長(zhǎng),預(yù)防感染,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。體外96孔板法研究顯示,MRSA具有強(qiáng)大的生物膜形成能力;LL-37具有抗生物膜活性,在1/20MIC亞抑