人抗菌肽LL-37的原核表達及其抗小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA感染活性的初步研究.pdf

1、LL-37是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽Cathelicidin家族的唯一成員,由37個氨基酸殘基組成,因其N端前兩個氨基酸殘基為亮氨酸(L)而得名。LL-37抗菌譜廣,體外研究顯示對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、病毒均發(fā)揮抑制作用,特別是對部分臨床耐藥菌及臨床易感菌株也有較強的抑菌活性,因此有很好的應用前景。本文采用原核表達系統(tǒng)實現(xiàn)小分子抗菌多肽LL-37的可溶表達,并研究其在皮膚創(chuàng)傷感染中發(fā)揮的活性作用。本課題將LL-37連接入pET32

2、a載體中進行可溶表達,通過考察表達誘導因素獲得高產(chǎn)量的LL-37,體外實驗驗證其抗菌活性,最后研究LL-37對于小鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染的預防治療作用,并從抗細菌生物膜方面探討其作用機制。
　　研究目的:
　　本文主要是采用pET32a表達載體實現(xiàn)LL-37的可溶表達,同時還探討了LL-37對于小鼠深Ⅱ度燙傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)創(chuàng)傷感染模型的預防治療作用,并對其機制進行初步研

3、究,為小分子抗菌肽的基因工程表達提供參考,也為LL-37的深入研究和開發(fā)應用提供實驗依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.融合蛋白Trx-LL-37的生物信息學分析及表達載體構建:運用相關生物信息學軟件對融合蛋白Trx-LL-37氨基酸序列進行分析預測,初步了解融合蛋白的理化性質、親/疏水性、二級結構以及可溶表達概率。參考GenBank中已發(fā)表的LL-37全長cDNA基因序列(No.:CAA46115)以及 pET32a(+)多克

4、隆位點序列,設計兩條特異性引物,PCR擴增出含有LL-37成熟肽的基因序列,引入KpnⅠ、SacⅠ酶切位點以及甲酸裂解位點。通過KpnⅠ、SacⅠ雙酶切反應,將含有LL-37的小片段連接入pET32a表達載體中,進行菌落PCR、雙酶切以及質粒測序鑒定。
　　2.LL-37的原核表達、純化及鑒定:將構建好的表達載體pET32a-LL-37轉化入BL21(DE3)中進行表達,采用SDS-PAGE、WesternBlot對表達產(chǎn)物進行鑒

5、定。以融合蛋白Trx-LL-37的可溶蛋白表達水平為指標,通過誘導條件及表達條件的單因素優(yōu)化,確定最佳表達參數(shù)。通過Ni2+親和層析色譜法純化融合蛋白Trx-LL-37,甲酸裂解去除標簽蛋白,再次采用Ni2+親和層析色譜法純化目標蛋白LL-37。
　　3.LL-37抗小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA創(chuàng)傷感染活性初步研究:選取金黃色葡萄球菌S.aureus、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌S.epidermidis、大腸桿菌E.

6、coli、銅綠假單胞菌P.aeruginosa、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等臨床常見感染菌種作為實驗對象,采用瓊脂孔穴擴散法及微量肉湯稀釋法,驗證純化產(chǎn)物LL-37的抑菌活性。建立小鼠深Ⅱ度燙傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷感染模型,以生理鹽水為陰性對照、慶大霉素為陽性對照,通過統(tǒng)計分析體重變化、組織菌負荷、感染愈合時間、創(chuàng)面愈合率等指標探討了LL-37的治療效果。
　　4.LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究:采過96

7、孔板法,以金黃色葡萄球菌作為陽性菌對照,探討了MRSA的體外成膜能力。然后結合激光共聚焦實驗研究了LL-37對MRSA生物膜形成的影響以及對已形成的MRSA生物膜的破壞作用。
　　結果:
　　1.融合蛋白Trx-LL-37生物信息學分析及表達載體構建:經(jīng)過生物信息學軟件預測分析,融合蛋白Trx-LL-37基因編碼蛋白含有195個氨基酸,分子量為21.5kDa,理論等電點為6.3,熱穩(wěn)定性好、半衰期長,屬于穩(wěn)定類蛋白;融合蛋白

8、二級結構簡單,主要包含α-螺旋、無規(guī)則卷曲;根據(jù)兩個參數(shù)模型預測顯示,重組融合蛋白具有可溶性表達的傾向,可采用基因工程技術進行表達。特異性引物PCR擴增出含有LL-37成熟肽的基因序列,引入特異性酶切位點以及甲酸裂解位點。經(jīng)KpnⅠ、SacⅠ雙酶切后連接入pET32a表達載體,進行菌落PCR、雙酶切以及質粒測序鑒定,片段大小以及氨基酸序列均與GeneBank公布一致。
　　2.LL-37的原核表達、純化及鑒定:構建的表達菌BL21

9、(DE3)/pET32a-LL-37經(jīng)誘導表達,SDS-PAGE、WesternBlot對表達產(chǎn)物鑒定結果顯示,IPTG誘導后的菌體蛋白在21.5kDa附近存在目標蛋白(Trx-LL-37)條帶,而未誘導的未出現(xiàn)相應大小的條帶。誘導表達條件經(jīng)過優(yōu)化,種子菌180rpm37℃培養(yǎng)2.5h,加入終濃度0.05mMIPTG,于17℃低溫誘導,培養(yǎng)24h,此時融合蛋白Trx-LL-37表達量最高,重組蛋白在總可溶蛋白中的比例也最高,達到45％以

10、上。融合蛋白Trx-LL-37經(jīng)Ni2+親和層析色譜法一次純化,甲酸裂解去除標簽蛋白,Ni2+親和層析色譜法二次純化,最終獲得目標蛋白LL-37。終產(chǎn)量為每升發(fā)酵液得到目標蛋白LL-37約3mg。經(jīng)RP-HPLC色譜分析,峰面積結果顯示,目標蛋白純度在90%以上。
　　3.LL-37抗小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA創(chuàng)傷感染活性初步研究:瓊脂孔穴擴散法及微量肉湯稀釋法實驗結果顯示,產(chǎn)物 LL-37對于臨床常見感染菌種具有抑菌活性,并且其 M

11、ICs以及 MBCs與經(jīng)典文獻一致。本實驗建立小鼠深Ⅱ度燙傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷感染模型,觀察 LL-37對創(chuàng)面感染的影響,以生理鹽水為陰性對照、慶大霉素為陽性對照,進行比較。每日觀察發(fā)現(xiàn),治療組小鼠精神狀態(tài)正常,進食、休息等活動均未受到影響,體重正常增長;生理鹽水組小鼠精神萎靡,毛發(fā)無光澤,體重水平一直處于治療組小鼠之下。具體結果顯示, LL-37組第3d創(chuàng)面即干燥結痂,痂下濕潤,滲出物相比對照組明顯減少,局部組織菌負荷比對照

12、組低了約3.5-Log(CEU/gtissue),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明LL-37有效降低了局部組織菌負荷,能夠及時抑制早期燙傷創(chuàng)面細菌的定植與增長,預防控制感染的發(fā)展。第9d,LL-37組創(chuàng)面明顯縮小,痂下肉芽組織生長迅速,愈合率與慶大霉素組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。9dHE病理切片還發(fā)現(xiàn),生理鹽水組創(chuàng)面正下方皮下組織分布有膿細胞碎片,可見炎癥細胞浸潤,而治療組均無;除此,LL-37皮下出現(xiàn)大量成纖維母細胞及新生血

13、管,修復狀況明顯優(yōu)于對照組。從另一方面說明,LL-37對模型小鼠燙傷創(chuàng)面具有促愈合修復作用。綜上, LL-37對小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA感染創(chuàng)傷模型具有一定效果。
　　4. LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究:96孔板法聯(lián)合結晶紫染色結果顯示,MRSA與陽性質控菌株S.aureus(ATCC25923)相比,兩者成膜能力相當,在統(tǒng)計學意義上無顯著差異(P>0.05)。然后,本實驗選取6.25、3.13、0.625、0.0625μ

14、M4個亞抑菌濃度,研究LL-37對于MRSA體外生物膜形成的影響,發(fā)現(xiàn)LL-37不僅作用于生物膜形成的初始階段——細菌的附著,還對已成型的生物膜具有殺傷破壞作用。結果顯示,LL-37在1/20MIC濃度對生物膜形成的抑制作用即有統(tǒng)計學意義,1/4 MIC3.13μM條件下對生物膜形成的抑制率達63%;在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到,1/4MICLL-37作用48h后,MRSA生物膜內(nèi)組成細菌數(shù)目明顯減少,成形的菌斑結構疏松,無信號區(qū)居多,

15、生物膜較薄,平均厚度僅為未加藥組的1/4。
　　結論:
　　本研究通過原核系統(tǒng)可溶表達得到融合蛋白Trx-LL-37;融合蛋白經(jīng)甲酸裂解、兩步Ni柱純化獲得目標蛋白LL-37,體外抑菌試驗證明其具有抑菌活性。通過對小鼠深Ⅱ度燙傷MRSA感染創(chuàng)面治療發(fā)現(xiàn),LL-37能夠抑制感染創(chuàng)面細菌的定植與生長,預防感染,促進創(chuàng)面愈合。體外96孔板法研究顯示,MRSA具有強大的生物膜形成能力;LL-37具有抗生物膜活性,在1/20MIC亞抑