黑素皮質(zhì)素受體-2在斑禿組織中表達(dá)異常及其可能機(jī)制的探討.pdf

1、斑禿(alopecia areata,AA)是在一定遺傳背景下,多種因素誘發(fā)的局限于毛囊的自身免疫性疾病。應(yīng)激可誘發(fā)和加重斑禿,目前認(rèn)為斑禿是一種應(yīng)激相關(guān)的炎癥性皮膚病。應(yīng)激反應(yīng)與下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPAaxis)、交感神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)緊密相關(guān),其中被稱為應(yīng)激軸(stress axis)的HPA軸,是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要途徑。HPA軸系統(tǒng)反應(yīng)缺陷將導(dǎo)致糖皮質(zhì)激

2、素缺乏狀態(tài),可增加自身免疫性疾病的易感性,是應(yīng)激相關(guān)的自身免疫性疾病的重要致病因素之一。
　　 目前發(fā)現(xiàn)除了經(jīng)典的中樞HPA軸,外周組織皮膚及其附屬器也存在著與中樞HPA軸相似的HPA軸。皮膚及毛囊的HPA軸與中樞HPA軸不但具有相同的環(huán)路分子而且具有相似的神經(jīng)內(nèi)分泌功能,與神經(jīng)遞質(zhì)、其它神經(jīng)肽以及神經(jīng)營養(yǎng)素共同調(diào)控生理病理狀態(tài)下皮膚的神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫功能。近來一些研究顯示,中樞及外周的HPA軸活動缺陷均參與應(yīng)激相關(guān)的斑禿的發(fā)病

3、,但其具體機(jī)制尚未完全闡明。
　　 HPA軸的組成分子也被稱為應(yīng)激激素(stress hormones),包括促皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropichormone,ACTH)和皮質(zhì)醇(cortisol)。CRH信號必須經(jīng)過.ACTH/MC2R途徑刺激皮質(zhì)醇生成,ACTH被稱為“內(nèi)分泌第二信使”;而且ACTH在幾個黑素皮

4、質(zhì)激素原肽(proopiomelanocortin,POMC)衍生肽中,是主要調(diào)節(jié)毛發(fā)生長的POMC衍生肽,因此ACTH及其特異性的受體黑素皮質(zhì)素受體2(melanocortin receptor type2,MC2R或adrenocorticotropic hormone receptor,ACTHR)在應(yīng)激相關(guān)的斑禿中可能發(fā)揮重要作用。我們對MC2R基因及其蛋白在斑禿皮損中的表達(dá)情況進(jìn)行研究,以闡明HPA軸在斑禿發(fā)病中的可能機(jī)制,并

5、探討影響MC2R分子功能的可能調(diào)控機(jī)制。
　　 目前認(rèn)為斑禿也是一多基因決定的復(fù)雜性疾病,因此斑禿的遺傳學(xué)研究也是闡釋斑禿發(fā)病機(jī)制的途徑之一。斑禿家族的全基因掃描發(fā)現(xiàn)最大多點(diǎn)LOD值位于18號染色體的10-30CM之間,我們通過GenBank搜索該區(qū)域的基因,發(fā)現(xiàn)MC2R恰恰位于這個區(qū)域。已證實(shí)MC2R啟動子一些位點(diǎn)的多態(tài)性可降低ACTH/MC2R連接敏感性,導(dǎo)致ACTH/MC2R介導(dǎo)的HPA軸信號傳導(dǎo)障礙,皮質(zhì)醇生產(chǎn)減少。認(rèn)為

6、MC2R基因的這種單個基因的單個鹼基突變導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)醇生成減少,是機(jī)體HPA軸活動調(diào)控的重要機(jī)制之一。中國漢族人群中MC2R啟動子這些位點(diǎn)的多態(tài)性降低ACTH與MC2R結(jié)合能力的研究已有報道。綜合斑禿患者異常的HPA軸活動和MC2R基因結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn),我們運(yùn)用病例對照研究方法,對重慶地區(qū)斑禿患者M(jìn)C2R基因啟動子兩個位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了檢測,統(tǒng)計學(xué)分析MC2R基因啟動子多態(tài)性與斑禿的關(guān)聯(lián)性,嘗試闡明影響斑禿HPA軸異常的可能因素。

7、　　 首先我們應(yīng)用Thomas Holmes和Richard Rahe社會再適應(yīng)量表調(diào)查斑禿患者病情活動期前6個月的應(yīng)激狀態(tài),探討應(yīng)激生活事件與斑禿發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性。然后,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了MC2R蛋白在斑禿皮損及健康對照頭皮組織的原位表達(dá)情況,并且應(yīng)用Western blotting方法對斑禿皮損與健康對照頭皮組織MC2R蛋白的總體水平做了定量檢測,定位定量地對MC2R蛋白水平在斑禿皮損中的改變進(jìn)行了全面研究。進(jìn)而,我們進(jìn)行

8、了斑禿皮損與健康對照頭皮組織MC2R的基因水平的檢測與比較研究,求證MC2R是否在頭皮組織中合成,探討斑禿皮損是否存在MC2R基因水平的改變。最后,我們用連接酶檢測方法對MC2R啟動子區(qū)的兩個位點(diǎn)的SNP做了研究,從遺傳學(xué)角度探討MC2R與斑禿發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。
　　 研究主要結(jié)果如下:
　　 1.50.95％的斑禿患者在病情活動前6個月經(jīng)歷過3個及以上的應(yīng)激生活事件,32.05％的健康對照在填表前6個月經(jīng)歷過3個及以上的應(yīng)

9、激生活事件,斑禿患者罹患應(yīng)激事件百分率明顯高于健康對照(P＜0.001);斑禿患者的SRRS評分顯著高于健康對照組(Z=6.628,P＜0.001),斑禿患者與健康對照人群在應(yīng)激感受上存在顯著差異。經(jīng)多因素logistic回歸分析,睡眠改變、個人習(xí)慣改變、家庭問題、學(xué)習(xí)工作問題及財政問題是與斑禿發(fā)生及加重相關(guān)的主要應(yīng)激生活事件,提示應(yīng)激與斑禿活動相關(guān)。
　　 2.免疫組化示:MC2R在表皮、附屬器及真皮組織中均廣泛表達(dá),在附屬器

10、表達(dá)最明顯,主要為細(xì)胞膜上與細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)。斑禿患者皮損MC2R表達(dá)較健康對照頭皮在皮膚全層組織,包括表皮、毛囊、皮脂腺及真皮中的表達(dá)普遍降低(P＜0.05),尤其在毛囊的外毛根鞘(outer root sheath,ORS)、毛母質(zhì)及表皮的棘細(xì)胞層與顆粒細(xì)胞層中表達(dá)降低顯著。MC2R蛋白表達(dá)在斑禿表皮及間充質(zhì)組織均廣泛改變,提示MC2R蛋白可能參與斑禿皮損包括表皮及真皮成分的組織病理學(xué)改變,顯著的表皮表達(dá)改變提示MC2R在斑禿表皮病理改

11、變中發(fā)揮更重要的作用。
　　 3.Western blotting示:斑禿患者皮損中MC2R總蛋白水平較健康頭皮組織表達(dá)降低(P＜0.05),半定量顯示了斑禿皮損與健康對照頭皮MC2R蛋白表達(dá)差異。
　　 4.MC2R mRNA在健康頭皮的表達(dá)量不高,而斑禿皮損MC2R mRNA表達(dá)較健康頭皮表達(dá)增加將近5倍,統(tǒng)計學(xué)檢驗具有顯著性(P＜0.01)。
　　 基于3與4的結(jié)果,我們認(rèn)為斑禿皮損中MC2R基因與蛋白水平

12、均發(fā)生改變,MC2R基因與蛋白水平表達(dá)的不一致性,提示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能在MC2R的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用,MC2R mRNA不能完全有效翻譯為MC2R蛋白可能是形成斑禿組織中HPA軸功能缺陷的關(guān)鍵因素之一。
　　 5.利用生物信息學(xué)方法,選擇MC2R基因啟動子的-759A＞C(rs1893220)及-2T＞C(rs79533878)位點(diǎn)進(jìn)行SNP研究。首先證實(shí)這些位點(diǎn)在中國人群確實(shí)存在基因多態(tài)性,然后比較發(fā)現(xiàn)斑禿患者與正常對照MC

13、2R基因-759A＞C、-2T＞C等位基因頻率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。但當(dāng)我們將斑禿患者按照應(yīng)激狀態(tài)分層分析,發(fā)現(xiàn)明顯應(yīng)激組的斑禿患者與健康對照者M(jìn)C2R基因的-2T＞C的等位基因頻率相比有統(tǒng)計學(xué)差異(41.1％比27.8％,P=0.009,OR=1.252,95％CI=1.045～1.501)。將結(jié)果以非參數(shù)Logistic回歸校正年齡及性別因素后分析,顯示明顯應(yīng)激組的斑禿患者與MC2R基因的-2T＞C位點(diǎn)的C等位基因攜帶有

14、相關(guān)性(P=0.002,OR=1.576,95％CI=1.148～2.162)。我們的研究結(jié)果提示MC2R基因-2T＞C多態(tài)性與斑禿患者的應(yīng)激感受有關(guān)聯(lián)性,推測MC2R基因-2T＞C位點(diǎn)T→C單個鹼基的突變降低了ACTH/MC2R連接敏感性,從而不能有效下傳HPA系統(tǒng)的CRH信號,造成糖皮質(zhì)激素生成不足,使自身免疫性疾病斑禿的易感性增加,斑禿患者的精神癥狀易感性增加。
　　 綜上所述:我們的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激生活事件是斑禿發(fā)生的風(fēng)險因

15、素之一,斑禿患者與健康對照人群在應(yīng)激感受上存在顯著性差異。斑禿皮損區(qū)MC2R基因及蛋白表達(dá)水平與健康對照頭皮組織表達(dá)有明顯差異,HPA軸表達(dá)異常參與斑禿的發(fā)病。過度應(yīng)激刺激下,為維護(hù)機(jī)體正常機(jī)能,HPA軸首先發(fā)生過度的中樞及外周應(yīng)激反應(yīng),表現(xiàn)為MC2R基因在皮膚中合成增加。而缺陷的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使MC2R基因不能完全表達(dá)為MC2R蛋白,導(dǎo)致MC2R蛋白表達(dá)降低。下調(diào)的MC2R蛋白致使HPA軸信號不能有效下傳,糖皮質(zhì)激素生成缺乏,增加自身免疫

16、性疾病斑禿的易感性。我們推想MC2R的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制可能是形成斑禿組織中缺陷的HPA軸功能的關(guān)鍵機(jī)制之一。MC2R基因啟動子的某些位點(diǎn)能夠影響ACTH/MC2R連接敏感性導(dǎo)致缺陷的HPA軸活動。我們調(diào)查發(fā)現(xiàn)MC2R基因啟動子-2T＞C(rs79533878)位點(diǎn)SNP與斑禿患者的應(yīng)激感受關(guān)聯(lián),推測MC2R基因啟動子區(qū)-2位點(diǎn)基因突變能夠引起ACTH/MC2R連接敏感性降低,導(dǎo)致HPA軸CRH信號不能有效下傳,致使糖皮質(zhì)激素生成缺陷,增加