強(qiáng)精片對(duì)不育大鼠生精微環(huán)境及睪丸BTB影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：生精微環(huán)境是血-睪屏障內(nèi)各種生殖細(xì)胞（支持細(xì)胞、生精干細(xì)胞、各級(jí)生精細(xì)胞和精子）以及各種調(diào)節(jié)因子共同構(gòu)成的一個(gè)相對(duì)封閉的細(xì)胞外環(huán)境，直接參與生精過程的調(diào)節(jié)，為精子發(fā)生的必要基礎(chǔ)。閉鎖蛋白（Occludin）是睪丸內(nèi)緊密連接（tight junction）的主要蛋白之一，參與構(gòu)建TJ和血-睪屏障（blood-testis barrier，BTB），后者為生精微環(huán)境的存在提供了的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前已正式occludin能夠調(diào)節(jié) TJ電阻，

2、干擾 BTB，阻斷精子發(fā)生。Cx43屬膜蛋白家族，參與構(gòu)建了縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通信(gap junctional intercellular communication，GJIC)。目前證實(shí)Cx43為睪丸內(nèi)含量最豐富的連接蛋白，大量分布于支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及支持細(xì)胞與生殖細(xì)胞的連接處，協(xié)調(diào)生殖細(xì)胞間功能，調(diào)控生精微環(huán)境，維持精子的發(fā)生。院內(nèi)制劑“強(qiáng)精片”的前期研究已證實(shí)該藥能夠改善不育患者精液指標(biāo)，并能提高附睪內(nèi)多種活性物質(zhì)含量，但

3、對(duì)睪丸生精微環(huán)境內(nèi)BTB及細(xì)胞間相互作用的影響仍是空白。因此本課題在“腎主生殖”理論指導(dǎo)下，旨在探討基于生精微環(huán)境中多種蛋白分子改變下中藥制劑強(qiáng)精片對(duì)不育大鼠的生殖保護(hù)作用，以期從微觀找到強(qiáng)精片改善精子狀態(tài)的新的分子基礎(chǔ)，為中藥治療不育提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：將70只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組20只與造模組50只，造模組采用雷公藤多甙灌胃法復(fù)制大鼠不育模型，空白組給予等計(jì)量羧基纖維素鈉灌胃。大鼠造模灌胃后第3w，隨機(jī)選取正常

4、組和模型組大鼠各10只，殺檢取材檢驗(yàn)造模是否成功。剩余40只模型大鼠隨機(jī)分為四組，即模型對(duì)照組、強(qiáng)精片低劑量組、強(qiáng)精片中劑量組、強(qiáng)精片高劑量組。其中中藥干預(yù)各組藥物用量分別按正常人用量的5倍、9倍、20倍計(jì)算，并給予相應(yīng)劑量的雷公藤多甙，模型組GTW灌胃，空白組給予羧基纖維素鈉，五組大鼠灌胃4w，每日1次，每周稱重調(diào)整用藥劑量，于末次灌胃2h后腹主動(dòng)脈取血處死，分離睪丸、附睪、精囊與前列腺進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
　　結(jié)果：⑴血清性激素

5、水平測(cè)定顯示，模型組與空白組相比，大鼠血清FSH值、LH值組間差異性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而血清睪酮T水平降低顯著(P<0.01)；與模型組相比，中藥干預(yù)各組血清睪酮 T值均有提高，且以高劑量組最為顯著（P<0.01）；而中藥各組對(duì)大鼠血清FSH、LH值的改善均不明顯（P＞0.05）；但強(qiáng)精片高劑量組較中、低劑量組LH有下降趨勢(shì)；取附睪精液檢測(cè)指標(biāo)顯示，灌胃3w后，模型對(duì)照組精子密度下降、精子活力下降，精子活率減低，與空白對(duì)照組

6、比較有極顯著差異(P<0.01)。說明模型大鼠睪丸內(nèi)存在生精障礙，實(shí)驗(yàn)造模成功。中藥干預(yù)后，各劑量中藥組在精子密度、精子活力及活率方面均有大幅度提高(P<0.01)，并顯示出一定量效關(guān)系趨勢(shì)。⑵稱重性腺及其附屬器官質(zhì)量計(jì)算結(jié)果顯示：強(qiáng)精片能夠增加睪丸與附睪質(zhì)量(P<0.05)，其中附睪更為明顯(P<0.01)，但對(duì)精囊、前列腺無顯著作用。HE染色病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：GTW模型大鼠睪丸內(nèi)生精小管管徑大小不一，部分管腔堵塞或坍塌，管壁菲薄，

7、生殖細(xì)胞減少，細(xì)胞間隙增大，管腔內(nèi)可見脫落細(xì)胞，成熟精子消失，局灶性精子管壞死，間質(zhì)水腫。中藥干預(yù)后能有效緩解局部生殖細(xì)胞的壞死，有效減輕GTW睪丸病理形態(tài)學(xué)改變，部分恢復(fù)組織的生精功能。⑶分別應(yīng)用免疫組化和Western Blot法測(cè)定ABP和FasL在不育SD大鼠睪丸組織中的表達(dá)，與空白組相比，模型組FasL及ABP表達(dá)量明顯升高（P<0.01），應(yīng)用中藥強(qiáng)精片干預(yù)4w后，各治療組睪丸組織ABP及FasL表達(dá)均有所下降，其中高劑量組

8、ABP和FasL蛋白表達(dá)顯著高于模型組（P<0.01或P<0.05）。⑷Western Blot半定性檢測(cè)睪丸組織內(nèi)OCLN及Cx43蛋白表達(dá)量，免疫組化法觀察OCLN蛋白在睪丸組織中的表達(dá)與分布。結(jié)果顯示模型組較空白組OCLN及Cx43蛋白表達(dá)量均有降低（P<0.01或P<0.05），給予中藥干預(yù)4w后，中藥各劑量組OCLN蛋白的表達(dá)量均有顯著提高（P<0.05），但Cx43蛋白僅在中劑量和高劑量組中較為明顯，其中中劑量組改善值具有統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：①雷公藤多甙可能通過上調(diào) Fas/FasL信號(hào)通路，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡，同時(shí)對(duì)OCLN蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，增加BTB通透性，破壞生精微環(huán)境，最終導(dǎo)致精子密度、活力、活率等指標(biāo)降低，造成不育。并且雷公藤多甙可能通過抑制Cx43蛋白表達(dá)影響SC和LC細(xì)胞功能，并干擾支持細(xì)胞調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的過程，這可能是GTW致不育的原因之一。②中藥強(qiáng)精片可能通過下調(diào) Fas/FasL系統(tǒng)，達(dá)到保護(hù)生精功能的作用，且該