實(shí)驗性大鼠左側(cè)精索靜脈曲張對睪丸Leydig細(xì)胞的影響.pdf

1、目的建立精索靜脈曲張(Varicocele，VC)大鼠模型，研究VC對血清睪酮和睪丸內(nèi)睪酮的影響；研究VC對睪丸Leydig細(xì)胞凋亡的影響，以探討VC是否引起Leydig細(xì)胞總量的變化；研究Leydig細(xì)胞內(nèi)StAR mRNA表達(dá)的變化，以探討單個Leydig細(xì)胞合成睪酮能力是否降低。以確定VC是否對睪丸Leydig細(xì)胞形態(tài)、功能產(chǎn)生影響。 方法： 1．購買青春期SD大鼠，分為4周對照組、4周實(shí)驗組；8周對照組、8周實(shí)

2、驗組，每組各10只。通過部分結(jié)扎左腎靜脈造成左側(cè)精索靜脈曲張模型，曲張精索內(nèi)靜脈內(nèi)徑增粗約3倍者作為實(shí)驗組。4周、8周時處死大鼠取出睪丸稱重，4[％]多聚甲醛/0.1M固定液固定，做HE染色。Image-pr0 plus 4.5彩色圖像分析系統(tǒng)下測量曲細(xì)精管直徑。 2.4、8周時處死大鼠，取靜脈血用放免法測定血清睪酮濃度；取部分睪丸組織稱重，按1/3(W/V)比例用甲醇勻漿；勻漿轉(zhuǎn)入15ml離心管中，室溫過夜；1800× g離

3、心30分鐘，提取上清液；烘干；以400ul二乙醚提純二次，提純液進(jìn)行放免法測定。 3.部分睪丸經(jīng)3[％]戊二預(yù)固定，1[％]四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型投射電鏡觀察。 4.原位細(xì)胞凋亡檢測(Tunel-POI)法)和凋亡指數(shù)計算：石蠟包埋的切片的預(yù)處理常規(guī)脫蠟水；用蛋白酶K(20ug/ml溶于Tris/t-HCL中，PH7.

4、4-7.8)室溫孵育20分鐘；滴加50ul的TUNEL反應(yīng)混合液標(biāo)記；加入50ul轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中37℃孵育；加入50ulDAB底物溶液，室溫孵育；蘇木素復(fù)染。凋亡指數(shù)計算：每個睪丸取一個切片，每張切片隨機(jī)取5個視野/400倍放大。計算出Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞凋亡陽性和陰性細(xì)胞數(shù)，再算出凋亡率。 5.石蠟切片原位雜交：石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水；30％H2O2一份+蒸餾水十份混合，室溫10分鐘以滅活內(nèi)源性酶；滴加3％檸檬

5、酸新鮮稀釋的胃蛋白酶消化20分鐘以暴露mRNA核酸片斷；1％多聚甲醛/0.1M后固定；按每張切片20um加預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)雜交；每張切片20um雜交液(lug/片)恒溫箱38℃雜交過夜；雜交后洗滌；滴加封閉液；滴加生物素化鼠抗地高辛；滴加SABC-AP，37℃40分鐘；BCIP/NBT按1：20比例用0.01MTBS(PH9.5)稀釋、混勻進(jìn)行BCIP/NBT顯色；0.1％核固紅復(fù)染。采圖，在Laserpix彩色圖像分析儀下分析Leydi

6、g細(xì)胞胞漿內(nèi)StAR mRNA表達(dá)的光密度。 結(jié)果： 1.實(shí)驗4周組左、右側(cè)睪丸平均重量與對照組相比無明顯減小(P>0.05)，8周實(shí)驗組左側(cè)睪丸平均重量(1.3563±5.6239g)與同期對照組左側(cè)睪丸重量(1.5895±5.0208g)相比減小(P<0.05)。實(shí)驗4周組雙側(cè)曲細(xì)精管直徑比同期對照組減小(P<0.05)；8周實(shí)驗組左、右側(cè)睪丸曲細(xì)精管直徑均比同期對照組減小(P<0.01)。4周、8周實(shí)驗組左側(cè)精索

7、靜脈直徑與同期對照組左側(cè)精索靜脈直徑相比明顯擴(kuò)張，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。 2.組織學(xué)觀察顯示：該模型大鼠的睪丸病理損害以生精上皮退化，精子發(fā)生阻滯，生精細(xì)胞脫落，曲細(xì)精管萎縮。損害為雙側(cè)性，且有累進(jìn)性特點(diǎn)。Leydig細(xì)胞變性增加，Leydig細(xì)胞數(shù)量減少。 3．血清睪酮：手術(shù)組4周(1.01±0.38)、8周(1.23±0.73)與同期對照組(4周，1.30±0.35；8周，1.59±1.12)相比有下降趨勢，但沒有統(tǒng)

8、計學(xué)意義。實(shí)驗組8周與實(shí)驗組4周相比下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組8周與對照組4周相比無差異。雙側(cè)睪丸內(nèi)睪酮水平：實(shí)驗組4周(左側(cè)，26.85±3.42；右側(cè)26.46±3.74，)與對照組4周(左側(cè)，28.67±3.57；右側(cè)，28.19±4.11)相比下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗組8周(左側(cè)24.84±4.56；右側(cè)25.04±3.90)與對照組8周相比下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗組8周與對照組4周相比下

9、降，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對照組8周與對照組4周相比無差異。 4．電鏡觀察：VC組大鼠Leydig細(xì)胞線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有不同程度的局灶性到彌漫性囊泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛擴(kuò)張的細(xì)胞呈篩狀；細(xì)胞核核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)呈斑塊狀，分布不均勻，核仁消失，染色質(zhì)固縮。雙測均可見到這些變化，左側(cè)為重。 5．實(shí)驗組4周或8周與同期對照組相比，Leydig細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著增高(P<0.01)。4周對照

10、組：左側(cè)，9.23±8.26；右側(cè)，8.91±5.96。4周試驗組：左側(cè)，18.73±12.80；右側(cè)，16.96±13.97。8周對照組：左側(cè)，9.24±7.041；右側(cè)，9.48±6.55。8周試驗組：左側(cè)，28.35±22.82；右側(cè)，17.66±13.80。實(shí)驗組雙側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡指數(shù)與同期對照組相比增高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。 6．StARmRNA表達(dá)強(qiáng)度(光密度)： 4周實(shí)驗組左側(cè)(0.157l±0.017

11、9)與4周對照組左側(cè)(0.1733±0.0287)相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；4周實(shí)驗組右側(cè)(0.1702±0.0340)與4周對照組右側(cè)(0.1808±0.0401)相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；8周實(shí)驗組左側(cè)(0.1540±0.0216)與8周對照組左側(cè)(0.2053±0.0334)相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；8周實(shí)驗組右側(cè)(O.1598±0.0218)與8周對照組右側(cè)(0.2084±0.0494)相比有統(tǒng)計學(xué)差異(

12、P<0.01)。 結(jié)論： 1．本實(shí)驗所采用的VC動物模型是目前國內(nèi)外公認(rèn)的成熟的疾病模型，實(shí)驗性大鼠左側(cè)精索內(nèi)靜脈明顯曲張，術(shù)后8周左側(cè)睪丸重量明顯減輕，組織學(xué)結(jié)果顯示雙側(cè)睪丸出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)損害，提示本研究動物模型成功、可靠，該模型為研究精索靜脈曲張的病理生理提供了有用工具。 2．在8周內(nèi)實(shí)驗性大鼠精索靜脈曲張并沒有引起血清睪酮的降低，但可以導(dǎo)致雙側(cè)睪丸內(nèi)睪酮降低，提示精索靜脈曲張損傷了Leydig細(xì)胞。