2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥(OP)是嚴重威脅中老年人群，尤其足絕經(jīng)后女性的一種全身性骨病，如何有效防治骨質(zhì)疏松已成為當今國內(nèi)外學者熱切關(guān)注的課題。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中的最常見類型，發(fā)生于絕經(jīng)后女性，雖然目前尚無確切流行病學資料數(shù)據(jù)，但美國第3次全國營養(yǎng)與健康調(diào)查顯示，全國50歲以上女性O(shè)P患病率13％-18％。加拿大OP多中心研究隨機調(diào)查結(jié)果顯示女性腰椎OP和股骨頸OP患病率分別為12.1％和7.9％，總患病率為15.

2、8％。20世紀90年代，歐洲29個研究中心（英國后來也加入）進行前瞻性O(shè)P研究（骨密度測量和腰椎變形研究），根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標準測量50歲以上女性人群股骨頸和粗隆間骨密度，結(jié)果顯示歐洲女性O(shè)P患病率為2％-11％，挪威50歲以上婦女中有14％-36％患OP。我國學者采用分層多階段整群抽樣方法對中國五大行政區(qū)的40歲以上人群進行調(diào)查，應用雙能X線骨密度儀（DXA）測量骨密度(BMD)，并按照WHO診斷標準，發(fā)現(xiàn)OP總患病率為

3、12.4％，其中男性為8.5％，女性為15.7％，兩者之間的籌異有統(tǒng)計學意義。
　　 骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制非常復雜，機體的骨重建失衡目前被認為是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本機制。骨重建是指去除骨骼局部舊骨代之以形成新骨的過程，足成熟骨組織的一種重要替換機制，是破骨細胞與成骨細胞一個成對的、相耦聯(lián)的細胞活動過程。破骨細胞(OC)是骨吸收的主要細胞，它的多少及活性直接決定骨吸收能力。成骨細胞(OB)足促進骨形成的細胞。骨吸收和骨形成的速率構(gòu)成骨

4、轉(zhuǎn)換率。骨重建過程受到遺傳、內(nèi)分泌、年齡和細胞因子等諸多因素影響，女性絕經(jīng)是骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要病因之一，越來越多的證據(jù)表明T2DM影響骨代謝，造成骨轉(zhuǎn)換率及骨量改變，使骨折危險性升高，T2DM對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨重建及骨轉(zhuǎn)換影響還不清楚。在維持骨重建的動態(tài)平衡中，系統(tǒng)或局部骨高長調(diào)節(jié)因子發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路在成骨細胞的發(fā)育及分化過程中扮演重要角色。人類遺傳學和動物研究表明，Wnt/低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)

5、/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是骨量形成的重要調(diào)節(jié)因子。tunt相關(guān)基因2（Runx2）是骨形成的關(guān)鍵基因，Runx2的表達是成骨細胞開始分化的標志。信號轉(zhuǎn)導通路Wnt/LRP5/β-catenin涉及Runx2活性或表達的調(diào)控。而核因子-κB(NF-κB)信號通路是在破骨細胞分化時的信號轉(zhuǎn)導途徑，核因子-1（B受體活化因子配體(RANKL)的信號可經(jīng)核因子-κB受體活化因子(RANK)傳遞給連接蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(T

6、RAF6)活化NF-κB，NF-κB再通過下游的活化T細胞核因子1蛋白(NFATc1)調(diào)節(jié)破骨細胞的形成。因此Wnt和NF-κB信號通路的相關(guān)因子表達改變可影響骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。
　　 我國2型糖尿病(T2DM)患病率快速增長，且年齡越大，患病率越高。資料顯示2型糖尿病影響骨轉(zhuǎn)換，導致骨折危險性增高。2型糖尿病和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松關(guān)系并不清楚。本研究通過制備2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型，測定骨密度及骨轉(zhuǎn)換生

7、化標記物，體外培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞，觀察骨組織基因mRNA表達，并結(jié)合臨床試驗探討2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥特點，為闡明2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子學機制及防治提供一條新思路。
　　 方法：
　　 動物實驗：
　　 第一部分：健康雌性Wistar大鼠100只，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組(NS，n=24)，去卵巢組(NOVX，n=26)，2型糖尿病組(DS，n=24)，2型糖尿病去卵巢組(DOVX，n=26)，組間

8、大鼠體重無統(tǒng)計學差異，其中糖尿病組(DS和DOVX)高糖高脂飼料（常規(guī)飼料中加入20％蔗糖、15％熟豬油、2.5％膽固醇）喂養(yǎng)8周后腹腔給予鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ0.1mmol/L，檸檬酸鈉配制，pH4.2)30mg/kg注射制備2型糖尿病動物模型，無糖尿病組(NS和NOVX)注射相同體積的檸檬酸緩沖液。1周后選取尾靜脈取血測空腹血糖(FBG)≥7.8mmol/L確定為T2DM動物模型，糖尿病模型復制成功1周后

9、無菌條件下NOVX和DOVX組大鼠麻醉后行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，NS和DS組僅去除部分脂肪，以去卵巢術(shù)當天為基值，0周各組大鼠測血糖(FBG)、胰島素(FINS)，計算胰島素敏感指數(shù)(IAI)。0、4、8和12周末雌激素(E2)水平、腰椎骨密度(BMD)。
　　 第二部分：于去卵巢術(shù)后第0、4、8、12周末每組大鼠隨機選取5只拉頸處死行成骨細胞和破骨細胞體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察成骨細胞數(shù)量、形態(tài)變化，傳代至第三代時堿性磷酸酶染色鑒

10、定成骨細胞，并用MTT法判斷成骨細胞生長活力。破骨細胞培養(yǎng)7天后，固定細胞，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，倒置相差顯微鏡下每孔計數(shù)。同期內(nèi)眥靜脈取血測定骨特異性堿性磷酸酶(BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)濃度。
　　 第三部分：于去卵巢術(shù)后第4、8、12周末，每組大鼠隨機選取5只分離脛骨置液氮冷凍后-80℃保存?zhèn)溆茫崛】俁NA時取出骨組織約100mg快速放入研缽中，加1mL Trizol裂解液磨碎，參

11、照Trizol RNA提取試劑說明書進行，反轉(zhuǎn)錄后以適量cDNA為模板擴增Runx2、LRP5、β-catenin、TRAF6、NF-κB、NFATc1的mRNA表達。 PCR產(chǎn)物在8％聚丙烯酰胺凝膠上200v恒壓電泳1h，溴化乙錠溶液染色10min，應用凝膠成像圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，計算相對表達量與β-actin比值。
　　 臨床試驗部分：選取150例門診查體無糖尿病絕經(jīng)后女性，年齡50-70歲，絕經(jīng)年限2-14年；15

12、0例該院內(nèi)分泌科住院2型糖尿病女性絕經(jīng)患者，年齡48-70歲，絕經(jīng)年限1-14年，符合1999年WHO糖尿病診斷標準。雙能X線骨密度測定儀(DXA)測定兩組人群腰椎2-4(L2-4)、股骨頸Neck)、大轉(zhuǎn)子(Great T)、粗隆間(InterTro)骨密度(BMD)，比較各部位骨量及骨質(zhì)疏松發(fā)生率情況。依照1998年WHO原發(fā)性骨質(zhì)疏松診斷標準，將糖尿病組所有入選患者分為骨量正常組(NP)、骨量減低組(DP)和骨質(zhì)疏松組(OP)，登

13、記年齡(Age)，絕經(jīng)年限(PMD)，糖尿病病程(DMD)，測定身高、體重，計算體重指數(shù)(BMI)。隨機血樣測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。靜脈血化驗空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FIns)、雌激素(E2)，Ⅰ型膠原C端肽(CTX-I)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)。探討絕經(jīng)后2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松發(fā)生的影響因素和骨轉(zhuǎn)換特點。
　　 結(jié)果：
　　 動物實驗第一部分：①血糖(F

14、BG):0周時糖尿病組(DS、DOVX)大鼠FBG顯著高于非糖尿病組(NS、NOVX)(p＜0.05)。②胰島素(INS)和胰島素敏感指數(shù)(IAI):0周時糖尿病組(DS、DOVX)大鼠胰島素明顯高于非糖尿病組(NS、NOVX)(p＜0.05)，0周時糖尿病組(DS、DOVX)大鼠胰島素敏感指數(shù)均明顯低于非糖尿病組(NS、NOVX)(p＜0.05)。③雌激素(E2)：0周時DOVX和DS組大鼠明顯低于NOVX和NS組（p＜0.05）；4

15、、8和12周時DOVX組大鼠明顯低于NS、NOVX和DS組（p＜0.05），NOVX組大鼠明顯低于NS組（p＜0.05）；8和12周DS組大鼠明顯低于NS組（p＜0.05）。④骨密度(BMD):4、8和12周DOVX、NOVX組大鼠骨密度均明顯低于NS組與DS組（p＜0.05），8和12周DS組大鼠明顯低于NS組(p＜0.05)。
　　 動物實驗第二部分：①BALP:0周時各組大鼠血清BALP均未見明顯差異(p＞0.05)。4周

16、時DOVX組大鼠血清BALP濃度與NS組比較無明顯差異（p＞0.05），與NOVX組比較明顯減低(p＜0.05)，與DS組比較無明顯差異(p＞0.05)；NOVX組大鼠血清BALP濃度明顯高于NS組(p＜0.05)；DS組血清BALP濃度與NS組比較無明顯差異（p＞0.05）。8周時DOVX組大鼠血清BALP濃度與NS和NOVX組比較無明顯差異(p＞0.05)，與DS組比較明顯升高(p＜0.05)；NOVX組血清BALP濃度與NS組比較

17、無明顯差異(p＞0.05)；DS組血清BALP濃度明顯低于NS組（p＜0.05）。12周時各組血清BALP濃度均無明顯差異（p＞0.05）。②TRACP5b：0周時各組大鼠血清TRACP5b均未見明顯差異(p＞0.05)。4周和8周時DOVX組TRACP5b濃度均明顯高于NS組（p＜0.05），與DS組和NOVX組比較均無明顯差異（p＞0.05）；NOVX組TRACP5b濃度明顯高于NS組(p＜0.05);DS組TRACP5b濃度明顯高

18、于NS組（p＜0.05）。12周時DOVX組TRACP5b濃度明顯高于NS組、NOVX組、DS組（p＜0.05）：NOVX和DS組TRACP5b濃度分別與NS組比較均無明顯差異（p＞0.05）。③成骨細胞增殖活力：4、8和12周時DOVX組大鼠成骨細胞生長活力與NS組比較無明顯差異(p＞0.05)，與NOVX組比較明顯減低(p＜0.05)，與DS組比較明顯增高(p＜0.05);NOVX組大鼠成骨細胞生長活力明顯高于NS組(p＜0.05)

19、;DS組大鼠成骨細胞生長活力明顯低于NS組（p＜0.05）。④破骨細胞計數(shù)：4、8和12周時DOVX組大鼠破骨細胞計數(shù)明顯高于NS和DS組(p＜0.05);NOVX組大鼠破骨細胞計數(shù)明顯高于NS組(p＜0.05);DS組大鼠破骨細胞計數(shù)明顯高于NS組(p＜0.05)。
　　 動物實驗第三部分：①Wnt信號通路相關(guān)因子表達：4、8和12周時DOVX大鼠LRP5和3-catenin表達均明顯低于NS組(p＜0.05)；4周時DOVX

20、大鼠Runx2表達與NS組比較無明顯差異（p＞0.05），8和12周時DOVX大鼠Runx2表達均明顯低于NS組(p＜0.05)。4、8和12周時NOVX大鼠LRP5和β-catenin表達均明顯低于NS組(p＜0.05)；4和12周時NOVX大鼠Runx2表達明顯低于NS組(p＜0.05)，8周時NOVX大鼠Runx2表達與NS組比較無明顯差異（p＞0.05）。4和8周時DS組大鼠LRP5和β-catenin表達均明顯低于NS組(p＜

21、0.05)，12周時DS組大鼠LRP5表達明顯低于NS組（p＜0.05），β-catenin表達與NS組比較無明顯差異。4和8周時DS組大鼠Runx2表達與NS組比較無明顯差異(p＞0.05)，12周時DS組大鼠Runx2表達明顯低于NS組。②NF-κB信號通路相關(guān)因子表達：4、8和12周時DOVX組大鼠TRAF6、NF-κB和NFATc1表達均明顯高于NS組。4周時NOVX組大鼠TRAF6表達明顯低于NS組(p＜0.05)，NF-κB

22、表達明顯高于NS組，NFATc1表達與NS組比較無明顯改變，8和12周時NOVX組大鼠TRAF6、NF-κB和NFATc1表達均明顯高于NS組。4周時DS組大鼠TRAF6表達明顯低于NS組，NF-κB和NFATc1表達均明顯高于NS組；8周時DS大鼠TRAF6表達與NS組比較無明顯改變(p＞0.05)，NF-κB和NFATc1表達均明顯低于NS組；12周時DS組大鼠TRAF6和NF-κB表達明顯高于NS組，NFATc1表達與NS組比較無

23、明顯變化。
　　 臨床研究部分：①絕經(jīng)后2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松患病率為54％;②絕經(jīng)后2型糖尿病患者各部位骨量與無糖尿病患者比較無明顯差異；③絕經(jīng)后2型糖尿病骨質(zhì)疏松組患者年齡、絕經(jīng)年限、糖尿病病程及空腹血糖水平明顯高于骨量減少和骨量正常組，胰島素和雌激素水平明顯低于骨量減少和骨量正常組；年齡、絕經(jīng)年限、糖尿病病程及空腹血糖與骨密度呈負相關(guān)，胰島素和雌激素水平與骨密度呈正相關(guān)；④2型糖尿病骨質(zhì)疏松組患者CTX-I、TRACP5b

24、、BALP水平明顯高于骨量減少和骨量正常組，CTX-I與腰椎2-4、股骨頸骨密度呈明顯負相關(guān)，與大轉(zhuǎn)子、粗隆間骨密度無明顯相關(guān)性；TRACP5b、BALP與腰椎2-4、股骨頸、大轉(zhuǎn)子、粗隆間骨密度呈明顯負相關(guān)，TRACP5b與各部位骨密度相關(guān)性最強。
　　 結(jié)論：
　　 1、實驗性2型糖尿病大鼠雙側(cè)卵巢切除4周成功建立2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型；
　　 2、2型糖尿病大鼠骨量低于正常大鼠；2型糖尿病卵巢切除大鼠骨

25、量與卵巢切除大鼠骨量無明顯差異：
　　 3、2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠重建特點表現(xiàn)為：骨形成穩(wěn)定，骨吸收活躍，其發(fā)生發(fā)展與糖尿病和卵巢切除有關(guān)；
　　 4、Wnt信號通路與NF-κB通路影響2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠骨重建，Wnt信號通路中β-catenin表達下降與NF-κB通路中NF-1B表達增強可能為2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要分子生物學機制之一；
　　 5、絕經(jīng)后2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松患病率54％。年齡增長、絕經(jīng)