耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）PBP2a C-末端的克隆、表達(dá)以及拮抗MRSA中藥的篩選.pdf

1、目的：MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus)感染是燒傷和嚴(yán)重創(chuàng)傷中最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，MRSA的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌主要與其mecA基因大量表達(dá)產(chǎn)生的特殊青霉素結(jié)合蛋白PBP2a有關(guān)。該蛋白由668個(gè)氨基酸組成，分子量為76.1 kDa，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素親和力低。水溶性的PBP2a為去除N-末端23個(gè)氨基酸后的蛋白質(zhì)(不影響PBP2a與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的結(jié)合)，其

2、有二個(gè)功能域：N-末端非青霉素結(jié)合域(24-326 aa)，C-末端(327-668 aa)功能域。目前已知N-末端負(fù)責(zé)蛋白的延伸和錨定；C-末端則具有轉(zhuǎn)肽酶活性和β-內(nèi)酰胺酶的作用。當(dāng)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抑制了由金葡菌產(chǎn)生的敏感的PBPs時(shí)，由于PBP2a對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素親和力極低，可以替代這些蛋白的功能進(jìn)行細(xì)胞壁的合成。在金葡菌臨床分離株中，日本、臺(tái)灣、新加坡的MRSA檢出率都>60％，意大利、葡萄牙的MRSA檢出率也都>50％。

3、這些臨床分離株大多是多重耐藥，僅對(duì)糖肽類(lèi)抗生素如萬(wàn)古霉素敏感。然而，1996年在日本分離到萬(wàn)古霉素中度敏感的MRSA，隨后2002年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素耐藥的MRSA，至今尚無(wú)有效的治療MRSA感染藥物，所以急需尋找新的的藥物來(lái)殺滅MRSA或減少其耐藥性。文獻(xiàn)報(bào)道有許多中藥具有抗MRSA的作用，所以極有可能從中藥里篩選到殺滅MRSA或減少其耐藥性的新藥或先導(dǎo)物。 基于如此嚴(yán)峻的MRSA感染及耐藥形勢(shì)，本研究旨在采用基因重組技術(shù)獲得

4、PBP2a C-末端，并以此為靶點(diǎn)應(yīng)用生物傳感器技術(shù)篩選具有與PBP2a C-末端高結(jié)合力的中藥，并對(duì)其活性組分分離研究，為進(jìn)一步分離純化抑制PBP2a的活性單體提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法：①M(fèi)RSA的鑒定：采用二倍微孔稀釋法測(cè)定β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素對(duì)MRSA細(xì)菌的最小抑菌濃度；采用PCR法鑒定mecA基因；②PCR方法擴(kuò)增編碼PBP2a C-末端的mecA基因的開(kāi)放閱讀框，構(gòu)建重組載體pQE30-mecA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)表達(dá)

5、PBP2a C-末端功能域，將對(duì)PBP2a C-末端多肽表達(dá)、純化及鑒定；③將PBP2a C-末端包被于生物傳感器的生物素化樣品池；④采用生物傳感器技術(shù)觀察測(cè)定115種中藥水煎液去鞣質(zhì)后與PBP2a c-末端的結(jié)合力；⑤選擇結(jié)合力較高的25種藥物水提液和醇提液與定量PBP2a C-末端(50 ng/ml)37℃混合孵育30 min，再測(cè)定其與PBP2a C-末端的結(jié)合力，以評(píng)價(jià)中藥里活性物質(zhì)的含量。⑥與PBP2a C-末端高結(jié)合力中藥與

6、B-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果的評(píng)價(jià)。⑦黃連活性組分的分離及體外抗菌活性測(cè)定。 結(jié)果：①26株MRSA臨床分離株對(duì)苯唑西林鈉、加替沙星、青霉素鈉、舒氨西林、泰能等均耐藥，而對(duì)萬(wàn)古霉素敏感；②26株MRSA臨床分離株中，有22株mecA基因檢測(cè)陽(yáng)性；③成功構(gòu)建重組載體pQE30-mecA，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)純化獲得可溶性PBP2a C-末端；④將PBP2a C-末端包被于生物傳感的生物素化樣品池；⑤采用生物傳感技術(shù)測(cè)定115種中

7、藥水煎液去鞣質(zhì)后與PBP2a C-末端的結(jié)合力；⑥將篩選出的結(jié)合力較高的25種中藥與定量PBP2a，C-末端的消耗實(shí)驗(yàn)后，黃藥子、五倍子、半枝蓮、山豆根、黃連、草果、核桃根等7種中藥具有較高的與PBP2a C-末端結(jié)合的物質(zhì)，與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素聯(lián)用后都能不同程度地降低其對(duì)MRSA的MIC。⑦分離的黃連活性組分能降低β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素對(duì)MRSA的MIC。 結(jié)論：PBP2a C-末端mecA基因原核表達(dá)載體可在大腸桿菌中高效表達(dá)，