耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的表達(dá)、抗體制備及膠乳凝集檢測方法的建立.pdf

1、目的PCR擴增編碼耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus，MRSA)青霉素結(jié)合蛋白2a(penicillinbindingprotein2a，PBP2a)轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的mecA基因片段，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，并制備相應(yīng)的多克隆抗體，初步建立檢測PBP2a的免疫學(xué)方法，為進(jìn)一步制備抗PBP2a單克隆抗體并開發(fā)試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法1、根據(jù)基因文

2、庫登錄的mecA基因的編碼序列，設(shè)計合成了一對含有酶切位點的寡核苷酸引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從MRSA基因組DNA中擴增獲得編碼PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的DNA片段，酶切后將此目的基因片段連接至經(jīng)過相同酶切的PET-His載體上，經(jīng)酶切鑒定、測序正確后，轉(zhuǎn)化E.coliBL2l(DE3)plysS，用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。然后利用Ni2+親和層析技術(shù)從表達(dá)蛋白中純化目的蛋白，并對表達(dá)的重組蛋白以進(jìn)口商品化MRSA膠乳凝

3、集試劑盒進(jìn)行鑒定。 2、以純化的目的蛋白為免疫原免疫新西蘭大白兔，獲得抗PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的多克隆抗體，對抗血清進(jìn)行純化，間接ELISA及Westernblot方法檢測制備第3頁的抗血清效價和特異性，并初步建立檢測PBP2a的膠乳凝集試驗。 結(jié)果1、PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可見在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1000bp附近有一清晰的擴增條帶，與目的片段預(yù)期大小一致；重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI、EcoRⅠ雙酶切，產(chǎn)物在預(yù)期大小處

4、出現(xiàn)條帶，表明目的基因已插入載體PET-His中；序列分析表明，重組質(zhì)粒的插入片斷序列與基因文庫登錄的目的片段序列(GenBank：X52593)僅兩個堿基位點不一致，無移碼突變，核苷酸同源性為99.8％。 2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)plysS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，與沒有經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的陰性對照相比，在38000處新增一明顯條帶，與理論相對分子質(zhì)量一致。目的蛋白的表達(dá)量可達(dá)到菌體總蛋白的32％；Ni2+親和層析

5、純化后，該位置可見一明顯條帶，且未見雜蛋白帶。純化的重組蛋白和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的提取液均能與包被有抗PBP2a特異性單克隆抗體的膠乳試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)，而對照空載體轉(zhuǎn)化菌的提取液則未見凝集出現(xiàn)。 3、獲得的抗血清經(jīng)ELISA方法檢測抗體滴度達(dá)到了1∶25600，Westernblot分析顯示該多克隆抗體與純化的PBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)蛋白、MRSA菌體蛋白提取液中天然的PBP2a蛋白均能發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，而與對照MSSA菌體蛋白提取液

6、則未見抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，表明制備的多克隆抗體具有良好的特異性。以純化的抗體致敏膠乳建立了檢測PBP2a的膠乳凝集試驗，所制備的膠乳試劑特異性、敏感性、穩(wěn)定性良好。 結(jié)論1、成功構(gòu)建了編碼MRSAPBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)基因的原核表達(dá)載體并獲得了重組蛋白的高效表達(dá)，制備了高純度的目的蛋白。 2、成功制備了抗MRSAPBP2a轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的多克隆抗體，并初步建立了敏感性、特異性良好的檢測PBP2a的乳膠凝集試驗，為進(jìn)一步制備單克隆抗體