結(jié)腸癌細胞OXA耐藥相關(guān)microRNA篩選及機制研究.pdf

1、目的:研究微小RNA(microRNA，miRNA)在結(jié)腸癌細胞奧沙利鉑(Oxaliplatin，OXA)耐藥中發(fā)揮作用的分子機制，尋找與耐藥相關(guān)的調(diào)控性分子，為制定有效的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方法奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.采用梯度誘導法建立OXA耐藥的結(jié)腸癌細胞。
　　 2.利用miRNA芯片技術(shù)和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測在耐藥的結(jié)腸癌細胞中差異性表達明顯的miRNA。

2、>　　 3.選取在耐藥細胞中低表達的miRNA-137作為研究對象，應用MTT方法驗證miRNA-137對結(jié)腸癌細胞SW480和HCT-15耐藥的影響。
　　 4.利用生物信息學方法篩選miRNA-137的候選靶基因YBX1，采用熒光報告載體實驗驗證miRNA-137對靶基因的直接調(diào)控作用。采用Real-time PCR和Westernblot實驗技術(shù)檢測miRNA-137功能增強的結(jié)腸癌細胞中靶基因YBX1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

3、和蛋白水平表達，驗證miRNA-137對靶基因的調(diào)控作用。用RNA干擾技術(shù)沉默該靶基因后，檢測結(jié)腸癌細胞對OXA的敏感性。
　　 5.通過熒光定量PCR和免疫組化實驗進一步驗證臨床結(jié)腸癌標本OXA耐藥性與hsa-miR-137和YBX1的表達之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.利用濃度為0.2～2.0μM的OXA建立了OXA耐藥的結(jié)腸癌細胞。
　　 2.hsa-miR-93、hsa-miR-191、hs

4、a-miR-137、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-96、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-192在人結(jié)腸癌親代細胞SW480和HCT-15與耐藥細胞SW480/OXA和HCT-15/OXA之間存在明顯差異性表達，在結(jié)腸癌細胞中進行MTT試驗，結(jié)果顯示:miR-93、miR-137、miR-21可調(diào)節(jié)OXA對結(jié)腸癌細胞的殺傷功能。
　　 3.熒光報告載體試驗中miRNA-137能夠通過作用

5、于YBX1基因的3'非翻譯區(qū)并對其表達進行負性調(diào)節(jié)。在miRNA-137表達減弱的結(jié)腸癌細胞中，YBX1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平都有明顯升高。
　　 4.在人結(jié)腸癌細胞SW480和HCT-15中，沉默YBX1后細胞對OXA和順鉑(CDDP)的耐藥性明顯減弱。
　　 5.Real-time PCR結(jié)果顯示miR-137的轉(zhuǎn)錄水平與結(jié)腸癌組織的耐藥性呈負相關(guān)趨勢。Western blot(WB)和免疫組化顯示YB