mag-2基因及與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究.pdf

1、利用抑制消減雜交結(jié)合基因芯片技術(shù)，從一對具有不同轉(zhuǎn)移能力的模型細(xì)胞株(人肺巨細(xì)胞癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)LA801D、C)中篩選獲得79條與轉(zhuǎn)移表型正相關(guān)EST片段。其中83號片段經(jīng)同源比對和電子延伸獲得全長序列NM 024293，將其命名為mag-2(metastasis-associated gene-2，mag-2)。前期的初步研究發(fā)現(xiàn)mag-2基因可能通過某些機制來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的和侵襲和轉(zhuǎn)移特性，是潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。 首

2、先對mag-2基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。mag-2基因定位于2q35，基因總長度約為5.2Kbp，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。ORF長度為1536bp，編碼一個長度為512aa的理論蛋白產(chǎn)物，分子量為55163.7 Da，是一種偏酸性蛋白，等電點為pH4.30。Mag-2蛋白以α螺旋為主，含有少量B片層結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲，具有15個豆蔻?；稽c、17個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和2個PKC磷酸化位點。由于沒有發(fā)現(xiàn)Mag-2與功能已知的蛋白的

3、序列存在同源性，未能預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)以及功能。從電子組織表達(dá)譜得知mag-2基因在人體多種正常組織中均有表達(dá)不同程度的表達(dá)。表達(dá)量最高的前10位組織依次為骨、脂肪、皮膚、睪丸、神經(jīng)、前列腺、卵巢、膀胱、腦和甲狀旁腺。Mag-2定位于細(xì)胞胞漿(可靠性為92.6％)，具體胞內(nèi)預(yù)測位置為：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)56.3％、囊泡21.0％、高爾基體10.3％、線粒體12.4％。 為了深入研究mag-2基因的cDNA全長、編碼蛋白的實際分子量大小、確切蛋白

4、定位以及功能，我們制備了mag-2多克隆抗體。我們在綜合預(yù)測mag-2蛋白抗原表位的基礎(chǔ)上，選定mag-2蛋白的349到365位的17個氨基酸殘基的多肽片段并在該肽段C末端加一個半胱氨酸，偶聯(lián)血藍(lán)蛋白(KLH)，作為免疫原來免疫日本大耳白兔，制備了高效價的多克隆抗體。該抗體具有很好的特異性，從而為深入研究該基因的功能提供了有力的工具。我們首次經(jīng)實驗確定mag-2蛋白產(chǎn)物只有一個，而且其相對分子質(zhì)量大小為約55kDa。mag-2在模型細(xì)胞

5、中的表達(dá)存在明顯差異，并在多種高轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中豐富表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，我們通過～系列實驗對mag一2基因的轉(zhuǎn)錄本、組織表達(dá)譜、腫瘤細(xì)胞表達(dá)情況、胞內(nèi)定位和胞外可分泌性等特性進(jìn)行了研究。實驗表明mag-2基因只有一個轉(zhuǎn)錄本，大小約為3,2Kbp。mag-2基因在人體多種組織中均有表達(dá)，但并非普遍表達(dá)。表達(dá)量從高到低的前10位組織依次為：黑質(zhì)、唾液腺、心尖、胎肝、胎脾、左心室、胰腺、膀胱、空腸和扁桃體。mag-2基因在多種不同組織來源的腫瘤

6、細(xì)胞HepG2、MCF-7、HL-60、Hela、PG和BE1中均有表達(dá)，在我們選取的多種肺組織來源的腫瘤細(xì)胞A549、H1299、Anip、PLA801D和H322也檢測到了Mag-2的表達(dá)。Mag-2蛋白質(zhì)在PLA801D細(xì)胞中主要呈顆粒樣分布于胞漿中，在HepG2細(xì)胞中情形也是相似的。我們在PIA801C、PIA801D的培養(yǎng)上清中均未檢測到Mag-2，推測Mag-2蛋白不能分泌到細(xì)胞外。 最為重要的，為探討mag-2基因

7、功能及其與腫瘤轉(zhuǎn)移表型的相關(guān)性，構(gòu)建了特異針對mag-2基因的RNAi穩(wěn)定表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染到PLA801D細(xì)胞中以抑制mag-2基因的表達(dá)，通過一系列細(xì)胞生物學(xué)功能實驗來分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的表型的變化，從而推斷mag-2基因功能以及與腫瘤轉(zhuǎn)移表型相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，mag-2的表達(dá)被抑制后，高轉(zhuǎn)移的模型細(xì)胞PLA801D的增殖速度明顯變小，集落形成能力明顯降低，與基底膜的粘附能力也明顯下降。相應(yīng)的，觀察細(xì)胞的遷移和侵襲能力明