抑癌基因PTEN與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究.pdf

1、[目的]第10號染色體上缺失的與張力蛋白同源的基因(phosphataseandtensinhomologydeletedchromosome10，PTEN)是繼發(fā)現(xiàn)P53后又一個與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抑癌基因，而且是發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因，也是最近研究較熱的基因之一。許多的文獻(xiàn)報道，PTEN基因阻礙細(xì)胞G1期向S期過渡，抑制細(xì)胞增殖，同時可以從多條信號途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但由于此基因在結(jié)構(gòu)上與張力蛋白高度同源

2、，且粘著斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)是其天然的作用底物，所以有理由推測PTEN基因?qū)?xì)胞的運(yùn)動遷移能力有著重要的影響。國外學(xué)者已經(jīng)在前列腺癌、膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)PTEN基因可以在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，但其作用機(jī)制尚未明了。本研究旨在探討PTEN基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞粘附、侵襲能力的影響及其機(jī)制，以期PTEN基因能成為乳腺癌轉(zhuǎn)歸、預(yù)后評價的有用指標(biāo)，為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。 [方法]利用脂質(zhì)體介

3、導(dǎo)法將pBP-wt-PTEN、pBP-G129R-PTEN和pBP-G129E-PTEN質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入PTEN基因缺失的乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-1，用嘌呤霉素成功篩選轉(zhuǎn)入的陽性細(xì)胞克隆，并通過PCR和Western-blot方法分別從基因和蛋白質(zhì)水平檢測質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)入并獲得表達(dá)。通過粘附、侵襲實(shí)驗(yàn)比較pBP-wt-PTEN、pBP-G129R-PTEN和pBP-G129E質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的粘附、侵襲能力差異。通過We

4、stern-blot方法檢測各組細(xì)胞的總FAK和p397-FAK磷酸化水平，免疫組化方法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和E-鈣連素(E-CD)的表達(dá)情況及RT-PCR檢測各組細(xì)胞P53mRNA水平分析PTEN基因?qū)AK磷酸化、MMP-2和E-cadherin表達(dá)和P53轉(zhuǎn)錄水平的影響，從而明確PTEN與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移間的關(guān)系及可能機(jī)制。 [結(jié)果](1)pBP-wt-PTEN、pBP-G129R-PTEN和pBP-G129

5、E-PTEN三種質(zhì)粒在DH5α細(xì)菌中成功轉(zhuǎn)化，并經(jīng)限制性酶切反應(yīng)確定所提取的質(zhì)粒是我們希望得到的三種質(zhì)粒。 (2)pBP-wt-PTEN、pBP-G129R-PTEN和pBP-G129E-PTEN三種質(zhì)粒同熒光質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染ZR-75-1細(xì)胞，通過可光下計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，熒光顯微鏡下計數(shù)成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)，而得到它們的轉(zhuǎn)染率分別為93.％、89％和90.5％。 (3)用0.8mg/mL嘌呤霉素從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中篩選到成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過

6、PCR和Western-blot證明篩選出的細(xì)胞是質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入并獲得表達(dá)的細(xì)胞。 (4)pBP-wt-PTEN、pBP-G129R-PTEN和pBP-G129E-PTEN三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞粘附抑制率分別為65.7％，8.8％和43.5％。侵襲抑制率分別為70.4％，6.9％和63.5％. (5)Western-blot分析表明pBP-wt-PTEN、pBP-G129R-PTEN和pBP-G129E-PTEN三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的

7、細(xì)胞總FAK水平差異無顯著性，但pBP-wt-PTEN細(xì)胞p397-FAK水平比pBP-G129R-PTEN細(xì)胞低而與pBP-G129E-PTEN細(xì)胞無差異。 (6)免疫組化分析表明pBP-wt-PTEN、pBP-G129R-PTEN和pBP-G129E-PTEN三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞MMP-2水平彼此間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，pBP-wt-PTEN細(xì)胞低于pBP-G129E-PTEN細(xì)胞、pBP-G129E-PTEN細(xì)胞低于pBP-G

8、129R-PTEN細(xì)胞。但它們間E-cadherin水平差異無顯著性。 (7)RT-PCR分析顯示，pBP-wt-PTEN細(xì)胞P53mRNA水平高于pBP-G129E-PTEN細(xì)胞、pBP-G129E-PTEN細(xì)胞高于pBP-G129R-PTEN細(xì)胞，但pBP-G129R-PTEN細(xì)胞與未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞間差異無顯著性。 [結(jié)論]野生型PTEN基因表達(dá)產(chǎn)物具有雙重特異性磷酸酶活性，包括脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。PTEN基