糖尿病對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌大電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道的影響.pdf

1、糖尿病是冠心病重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，國內(nèi)外指南指出糖尿病是冠心病的等危癥，但糖尿病引起冠心病的內(nèi)在具體機(jī)制尚未完全明確。大電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道（BK通道）廣泛分布于平滑肌細(xì)胞上，不僅參與細(xì)胞膜電位的形成，而且可以維持平滑肌細(xì)胞收縮和舒張的動(dòng)態(tài)平衡。糖尿病時(shí)冠狀動(dòng)脈血管收縮功能異常增高，可能與BK通道功能改變有關(guān)。
　　本研究將從BK通道功能改變這一角度來探討糖尿病與冠心病之間的關(guān)系。
　　目的：本研究擬采用多導(dǎo)微血管張力測定儀

2、、膜片鉗技術(shù)和Western Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討糖尿病對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道的影響，闡明糖尿病冠狀動(dòng)脈損傷的分子機(jī)制。
　　方法：
　?。?）采用鏈脲霉素腹腔內(nèi)注射建立糖尿病大鼠動(dòng)物模型，用酶消化“三步法”分離大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
　　（2）采用全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)記錄正常大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道電流，通過觀察加入多種特異性鉀通道阻滯劑后鉀通道電流的變化評(píng)估BK通道的分布。
　?。?）采用

3、多導(dǎo)微血管張力測定儀測定正常和糖尿病冠狀動(dòng)脈血管張力的變化，觀察BK通道對(duì)正常和糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈血管調(diào)節(jié)作用。
　　（4）全細(xì)胞膜片鉗以及單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)記錄正常和糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道電流。
　?。?）采用Western blot實(shí)驗(yàn)方法測定正常和糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道亞基的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建糖尿病模型大鼠，測得正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠血糖水平分別為(1

4、21.80±3.17)mg/dL和(562.50±13.50)mg/dL，符合造模要求，造模成功率達(dá)90％。分離得到符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，×100鏡下20~30個(gè)/視野。
　?。?）正常冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道電流約占總鉀離子流(65±4)％。
　?。?）當(dāng)加入BK通道特異性阻滯劑iberiotoxin(IBTX)100nmol/L后，冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)徑可縮小(65±4)％，而糖尿病冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑僅縮小約(15

5、±3)%。當(dāng)加入100mmol/L KCI后，正常和糖尿病冠狀動(dòng)脈血管張力分別為(398±38)mg和(390±35)mg(P>0.05)，當(dāng)加入100nmol/L IBTX后正常和糖尿病冠狀動(dòng)脈血管張力分別為(395±40)mg和(50±7)mg(P<0.05)。
　?。?）全細(xì)胞模式下，與正常組相比，當(dāng)刺激電壓>60mV時(shí)，糖尿病冠狀動(dòng)脈BK通道電流密度就開始降低，在刺激電壓為150 mV時(shí)，電流密度分別為(275±40) p

6、A/pF和(70±10)pA/pF(P<0.05)。
　?。?）單通道記錄時(shí)，在電極外液鈣離子濃度為1μmol/L，刺激電位為0、20、40、60、80、100和120 mV條件下，正常對(duì)照組大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道總開放概率（NP0）分別為0、0.0003±0.0001、0.0023±0.0007、0.0248±0.0043、0.0663±0.0369、0.3445±0.0445、1.2105±0.0481（n=5）；糖尿

7、病組大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道NP0分別為0、0.00002±0.00001、0.0003±0.0001、0.0026±0.0004、0.0257±0.0045、0.1361±0.0325、0.5217±0.1346（n=5）。糖尿病冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道NP0明顯低于正常冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道NP0(P<0.05)。
　?。?）經(jīng)過內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大

8、鼠冠狀動(dòng)脈BK通道α-亞基無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但BK通道β1-亞基蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　?。?）BK通道廣泛分布于冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上，對(duì)冠狀動(dòng)脈血管張力調(diào)節(jié)起重要作用。
　　（2）糖尿病時(shí)冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK通道功能受損，BK電流降低，血管張力增加。
　?。?）糖尿病冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BK通道β1-亞基表達(dá)減少，與冠狀動(dòng)脈BK通道電流降低以及血管張力增加有關(guān)，可能是糖