重組幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白融合疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 幽門螺桿菌(H.pylori)的全球感染率超過了50％，它是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與腸型胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)?，F(xiàn)有的根除H.pylori的手段主要是聯(lián)合應(yīng)用抗生素，但由于該菌感染的普遍性、耐藥菌株的不斷增加、較高的花費(fèi)以及病人的低依從性等，限制了抗菌藥物的療效。因此，接種簡便、成本低廉并易于大面積推廣的H.pylori疫苗的研究十分迫切。 中性粒細(xì)胞激活蛋白(

2、HP-NAP)為新近發(fā)現(xiàn)的H.pylori主要毒力因子之一，幾乎所有的幽門螺桿菌菌株都有表達(dá)。H.pylori尿素酶具有分布于細(xì)菌外膜、高度保守、顆粒狀結(jié)構(gòu)、分子量大和強(qiáng)免疫原性等特點(diǎn)，因此最早被作為H.pylori疫苗的侯選抗原。粘附于胃上皮細(xì)胞是H.pylori定植并致病的前提，阻斷H.pylori的粘附顯然可以防治H.pylori感染，所以，暴露于細(xì)菌表面并與H.pylori定植密切相關(guān)的粘附索HpaA是理想的候選抗原。粘膜免疫必

3、須輔以合適的佐劑，大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)就具有很強(qiáng)的粘膜免疫佐劑效應(yīng)。 因此，本研究擬對上述三種保護(hù)性抗原基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并與分子內(nèi)佐劑LTB串聯(lián)得到多亞單位的融合蛋白，分別觀察在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的不同免疫應(yīng)答和保護(hù)作用，為篩選有效的H.pylori疫苗抗原奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、采用PCR方法從H.pyloriSS1基因組中擴(kuò)增napA基因片段并構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET-11c中，通過酶切、測序鑒

4、定陽性重組子。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的H.pylorinapA基因序列進(jìn)行相似性分析。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用AKTA-explore純化儀純化表達(dá)的重組蛋白rNAP。應(yīng)用Tris-Tricine方法對表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物進(jìn)行分析，用純化的rNAP免疫家兔，并采用Westernblot和免疫擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定重組蛋白的免疫性。 2、采用重

5、疊延伸PCR的方法，以NAP做為融合蛋白前端，與粘膜佐劑LTB或HpaA-UreB414-LTB融合基因依次串聯(lián)，在片段問引入5個(gè)氨基酸的linkerPQDPP進(jìn)行連接；將融合基因構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，經(jīng)酶切及測序鑒定后，陽性重組子轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組工程菌表達(dá)。Tris-Tricine電泳和免疫印跡鑒定融合蛋白，DNAssist軟件分析融合蛋白理化特性，通過純化條件摸索，AKT

6、A-explore純化儀純化融合蛋白NapA-LTB(NL)和NapA-HpaA-UreB414-LTBNHUL)。純化后的融合蛋白分別與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。 3、將重組工程菌pET28a-hul/BL21進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過包含體洗滌進(jìn)行初純化，Tris-Tricine電泳和免疫印跡鑒定融合蛋白。 4、將110只小鼠隨機(jī)分為5組：PBS對照組、多亞單位分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(HpaA-UreB414-LT

7、B、NapA-HpaA-UreB414-LTB)、單一亞單位分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(NapA-LTB)、無分子內(nèi)佐劑單一亞單位蛋白組(NAP)。分別于0、7、14、28天口服免疫，劑量為150μg/只/次。末次免疫后10天，每組取10只小鼠剖殺取樣，ELISA檢測口服免疫后血清特異性IgG、IgA，胃、腸道粘液sIgA水平。每組余下12只口服攻毒108CFUH.pylori動(dòng)物適應(yīng)株，30天后，取小鼠胃部標(biāo)本通過H.pylori培養(yǎng)、快速

8、尿素酶試驗(yàn)及特異性PCR檢測，并計(jì)算口服免疫后各組攻毒保護(hù)率。 結(jié)果： 1、經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，H.pylorinapA基因被正確克隆到pET-11c中。NapA基因的核苷酸序列長度為432bp，與GenBank中序列比較，同源性為95％-98％，氨基酸序列的同源性為100％。重組工程菌IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)Tris-Tricine分析，表達(dá)的目的蛋白分子量約為17KD，其表達(dá)產(chǎn)物占菌體蛋白的50％，為可溶形式表達(dá)，

9、經(jīng)AKTA-explore100蛋白純化系統(tǒng)純化，純化后得到純度＞90％的目的蛋白。以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫家兔，制備兔抗rNAP特異抗體，經(jīng)免疫雙擴(kuò)散法檢測，兔抗血清抗體效價(jià)為1:32，WesternBlot結(jié)果也顯示重組蛋白能被兔抗H.pylori血清所識別。 2、經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了融合基因NapA-LTB和NapA-HpaA-UreB414-LTB，將融合基因NL和NHUL克隆到pET-22b(

10、+)載體上，得到了重組融合蛋白表達(dá)載體。將兩個(gè)陽性重組子轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)后，37℃培養(yǎng)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)Tris-Tricine和免疫印跡分析顯示分子量約為29KD和59KD。UVP掃描證實(shí)融合蛋白表達(dá)約占總蛋白30％和25％。融合蛋白以包涵體和可溶兩種形式表達(dá)，分別采用親和層析或離子交換層析的純化方法，純化后得到純度＞80％的融合蛋白。純化后的兩個(gè)融合蛋白分別能與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)

11、重組融合蛋白中LTB組分具有與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的生物活性，說明融合蛋白保持了LTB的天然活性，具有粘膜佐劑活性。 3、重組工程菌pET28a-hul/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)Tris-Tricine和免疫印跡分析顯示分子量約為42KD。融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，純化后得到純度＞80％的融合蛋白。 4、ELISA檢測融合蛋白rHUL和rNHUL免疫小鼠后血清特異性IgG、IgA，胃、腸道粘液sIgA

12、水平與PBS、rNAP組相比，升高明顯，差異極顯著(p＜0.001)，與rNL免疫組相比，差異顯著(p＜0.05)。免疫攻毒后，免疫保護(hù)率為：rNAP組16.7％，rNL組66.7％，rHUL組83.3％，rNHUL組90.9％。統(tǒng)計(jì)分析顯示，多亞單位融合蛋白組免疫保護(hù)率與PBS組相比，差異極顯著(p＜0.001)，與rNAP組相比，差異顯著(p＜0.05)，分子內(nèi)佐劑的三價(jià)融合蛋白組rNHUL保護(hù)率最高。 結(jié)論： 1、

13、成功克隆了H.pylorinapA基因，與GenBank已公布的H.pylori菌株基因序列具有高度同源性。純化的重組蛋白rNAP，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可以作為H.pylori基因工程疫苗候選抗原。 2、成功構(gòu)建、表達(dá)融合蛋白rNL和rNHUL，純化后的融合蛋白具有良好的抗原性；與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了重組蛋白中LTB組分具有能與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的生物活性。 3、誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白rHUL，經(jīng)包涵