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文檔簡介
1、目的:
艾滋病癡呆綜合征(ADC)是艾滋病中最常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,一般晚期HIV感染者易患此病,是由人類免疫缺陷病毒(Ⅰ)型(HIV-1)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)造成病人意識、行為和運動功能改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的綜合征。迄今為止,ADC的具體發(fā)病機制尚不清楚,但有多項研究證明HIV不能直接感染神經(jīng)元,而是通過感染腦組織內(nèi)的巨噬細胞和小膠質細胞,引發(fā)炎癥反應釋放細胞因子及自由基,最終損傷大腦神經(jīng)元。HIV感染可使人神經(jīng)膠質細胞表達
2、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素(IL)等多種具有潛在神經(jīng)毒性作用的細胞因子,其中TNF-α、IL-1β是ADC發(fā)病過程中最重要的兩種,它們能提高血腦屏障的通透性以利于HIV-1感染的單核-巨噬細胞侵入大腦,增強病毒復制,還能與趨化因子共同作用擴大炎癥反應,損害神經(jīng)元。
HIV-1的早期基因負調(diào)控因子(Nef)是HIV-1調(diào)節(jié)蛋白之一,能夠下調(diào)病毒轉錄,延長病毒壽命,增強病毒的復制能力和感染性,并干擾生長因子介導的與
3、增殖、分化和凋亡有關的信號通路,促進艾滋病病情的進展。
HIV-1為逆轉錄病毒,具有高度的變異性,而HIV-1基因的變異很有可能與ADC的發(fā)病機制相關。為了探討ADC患者體內(nèi)HIV-1nef基因的變異,以及這種變異所引起的氨基酸位點改變及其與ADC之間的關系等,本論文對一例ADC病人的CNS和外周共5個部位來源的25株HIV-1nef全序列進行了基因多樣性分析,并研究了nef基因變異導致的氨基酸位點的改變以及對U87細胞分泌T
4、NF-α、IL-1β的影響,為探討ADC的發(fā)病機制提供思路。
方法:
1.提取1例ADC病例尸檢標本的CNS(基底核、額葉灰質、腦膜、顳葉)和外周(脾)的共5個部位組織中的基因組DNA并以其為模板,PCR擴增HIV-1nef基因全序列,PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T克隆載體后轉化至大腸桿菌DH5α,經(jīng)氨芐青霉素及藍白班篩選挑取陽性菌落增菌后測序,序列經(jīng)BLAST分析后,每個部位取5個HIV-1nef序列,利用Bioe
5、dit、MEGA4等生物學軟件進行基因距離、系統(tǒng)進化樹、同義/非同義替換值(ds/dn)以及氨基酸位點變異等分析。
2.根據(jù)序列分析結果選取CNS和外周來源的基因變異較大的HIV-1nef陽性克隆各一株(共5株),將這5株陽性克隆以及本室保存的pcDNA3.1穿梭載體增菌后凝膠回收,并進行雙酶切,回收鑒定后以T4連接酶將經(jīng)過雙酶切的nef和pcDNA3.1連接,轉化至大腸桿菌DH5α,經(jīng)氨芐青霉素及藍白斑篩選出重組pcDNA3
6、.1-nef真核表達載體,用雙酶切鑒定證實。然后將重組pcDNA3.1-nef真核表達載體經(jīng)脂質體法轉染至U87細胞中,培養(yǎng)22~62h后經(jīng)免疫組化法及western-blot檢測Nef表達情況,并收集上清,ELISA法測定U87細胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。
結果:
1.成功克隆了一例ADC病人CNS和外周共5個部位來源的25株HIV-1nef基因,經(jīng)測序BLAST分析證
7、實均為HIV-1nef基因序列,并證明了該ADC患者感染的是HIV-1B亞型。與標準序列HXB2比較,通過系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),CNS和外周的nef基因序列位于進化樹中不同的進化枝上,表明該ADC患者體內(nèi)nef基因序列在CNS和外周中存在的核苷酸變異不同,而CNS不同部位的nef基因序列大多位于不同的進化枝上,且個別序列之間存在交叉現(xiàn)象,表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同部位的nef基因所存在的變異也不盡相同,由此說明HIV-1nef存在基因多樣性,且
8、可能在進化的過程中受到區(qū)室化作用影響,并存在遷移現(xiàn)象。而由組間基因距離分析可以看出,相同組織來源的nef序列基因距離較小,而CNS和外周的nef基因距離差異較大,可見不同的機體環(huán)境對基因變異也具有一定選擇作用。
2.通過對ds/dn值的研究發(fā)現(xiàn),該ADC病例所有HIV-1nef基因序列的ds/dn=2.3241±1.7529,外周組織的HIV-1nef基因序列的ds/dn=3.1809±1.1119,CNS的HIV-1nef基
9、因序列的ds/dn=1.7924±1.2213,ds/dn均大于1(P<0.05)。表明CNS和外周的HIV-1nef基因變異均受到負向選擇壓力,病毒自身變異起主要作用,同時機體傾向于清除有害的非同義突變。
3.氨基酸位點分析結果顯示,該ADC病例CNS和外周的Nef氨基酸變異位點及頻率均不同,有些氨基酸位點變異在CNS和外周都有發(fā)生,有些位點變異只發(fā)生在CNS,有些位點變異只發(fā)生在外周。
4.成功構建HIV-1ne
10、f基因的重組pcDNA3.1-nef真核表達載體,脂質體法轉染至U87細胞中,培養(yǎng)36~48h后免疫組化法檢測Nef蛋白表達情況,于細胞內(nèi)均可見到棕色顆粒沉淀,western-blot亦可檢測到目的蛋白的表達,說明重組pcDNA3.1-nef真核表達載體質粒轉染成功,并在U87細胞內(nèi)特異性表達。
5.ELISA檢測細胞上清中細胞因子含量,結果顯示,未轉染重組pcDNA3.1-nef真核表達載體的U87細胞上清的空白對照組與僅加
11、入轉染試劑及僅加入pcDNA3.1質粒的對照組相比,TNF-α、IL-1β的含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明轉染試劑及pcDNA3.1質粒均對U87細胞分泌TNF-α、IL-1β水平?jīng)]有影響;與空白對照組相比,Nef蛋白實驗組U87細胞上清中TNF-α、IL-1β的含量均有顯著升高(P<0.05),說明Nef蛋白能誘導并增強U87細胞分泌TNF-α、IL-1β,但CNS來源與外周組織來源的Nef蛋白對U87細胞TNF-α及IL
12、-1β的分泌量的影響沒有明顯的差異(P>0.05)。
結論:
1.ADC患者不同組織部位nef基因變異不同,其變異同時受到自身變異和環(huán)境選擇雙重作用,其中病毒自身變異起主要作用,同時機體傾向于清除有害的非同義突變。
2.不同組織部位Nef氨基酸變異不同,對Nef蛋白產(chǎn)生的影響亦不相同,可能導致Nef蛋白某些功能的改變,影響HIV-1在ADC患者體內(nèi)的復制、感染、凋亡等,可能與ADC發(fā)病機制有一定聯(lián)系,需進一
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