瘦素、脂聯(lián)素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1α表達(dá)的影響及其分子機(jī)制的探討.pdf

1、肥胖是常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)性疾病，常并發(fā)以胰島素抵抗、2型糖尿病、脂質(zhì)代謝紊亂為特征的代謝綜合征或動(dòng)脈粥樣硬化，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖及其相關(guān)的代謝病理變化伴有慢性炎癥反應(yīng)，脂肪組織存在大量巨噬細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)，肥胖者體內(nèi)TNF-α、IL-1α的濃度明顯高于正常人群，這些研究提示炎性因子TNF-α、IL-1α與肥胖有密切聯(lián)系。但目前為止，肥胖過(guò)程中炎性因子的產(chǎn)生與肥胖之間的關(guān)系尚未完全清楚，有待于進(jìn)一步闡明。 近年來(lái)的

2、研究表明，脂肪組織不僅是能量?jī)?chǔ)存和釋放的場(chǎng)所，而且具有內(nèi)分泌功能，能分泌多種脂肪細(xì)胞因子，如瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、抵抗素(resistin)等。脂肪因子具有廣泛的生物學(xué)功能，不僅參與物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，而且與肥胖過(guò)程中的炎性反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素能夠協(xié)同脂多糖(LPS)的作用，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-12等)表達(dá)，而脂聯(lián)素可以抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-αmRNA表達(dá)，但

3、瘦素、脂聯(lián)素能否直接調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生以及這種作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，目前并不清楚，有待于進(jìn)一步的深入探討。研究瘦素、脂聯(lián)素對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)及其相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有助于深入了解肥胖過(guò)程中炎性反應(yīng)的機(jī)制，并將為預(yù)防肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生提供新的思路。 研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)受到多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，MAPK和cAMP-PKA是其中兩個(gè)重要的信號(hào)系統(tǒng)。MAPK信號(hào)通路在脂多糖誘導(dǎo)的炎性因子(如TNF-α、IL-1等)表達(dá)中起著

4、重要作用，cAMP-PKA也與炎性因子的表達(dá)密切相關(guān)。但目前為止，瘦素、脂聯(lián)素是否通過(guò)MAPK或cAMP-PKA信號(hào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生，以及這兩條信號(hào)通路的交互對(duì)話(cross-talk)情況，尚無(wú)報(bào)道。闡明這一問(wèn)題將有助于進(jìn)一步了解肥胖過(guò)程中炎性因子產(chǎn)生的機(jī)制，對(duì)防治肥胖相關(guān)疾病具有重要意義。 炎性反應(yīng)是肥胖的特征之一，氧化應(yīng)激升高是肥胖的另一個(gè)重要特征。大量研究表明，ROS與肥胖的關(guān)系十分密切，人或小鼠體內(nèi)脂肪組

5、織的積聚與機(jī)體的氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)。機(jī)體內(nèi)ROS的升高受到多重因素的影響，其中脂肪細(xì)胞因子(瘦素、脂聯(lián)素)被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平的作用。ROS升高是引起炎性反應(yīng)異常的重要因素，ROS通過(guò)影響物質(zhì)代謝、炎性因子表達(dá)以及炎性反應(yīng)的信號(hào)通路而促進(jìn)異常的炎性反應(yīng)，但是瘦素、脂聯(lián)素影響的炎性反應(yīng)與這些脂肪因子引起的ROS變化之間的關(guān)系并不清楚，闡明瘦素、脂聯(lián)素與氧化應(yīng)激的關(guān)系將為進(jìn)一步明確肥胖與肥胖相關(guān)疾病的聯(lián)系提供可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制。

6、 本研究的目的在于探討瘦素、脂聯(lián)素對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子TNF-α、IL-1α的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為闡明肥胖和炎性反應(yīng)之間的關(guān)系提供分子和細(xì)胞機(jī)理，并為防治肥胖相關(guān)疾病提供新的治療靶點(diǎn)。 主要研究結(jié)果：Ⅰ瘦素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1α的影響以及MAPK信號(hào)通路在這一過(guò)程中的作用 在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中加入不同濃度的瘦素(0，25，50，75，100，20

7、0，500ng/ml)培養(yǎng)2h，結(jié)果表明各組劑量的瘦素都可以增加TNF-α、IL-1α蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，在25～75ng/ml的劑量范圍內(nèi)有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。 在體外培養(yǎng)的小鼠PM加入75ng/ml的瘦素培養(yǎng)不同的時(shí)間(0.5，1，2，6，12，24，48h)。隨著瘦素與PM作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF-α、IL-1α蛋白的表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，在0.5～2h內(nèi)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 小鼠PM預(yù)先與3

8、0μM的PD98059、10μM的U0126或10μM的SB203580、20μM的SP600125作用1h，再與75ng/ml的瘦素作用2h。PD98059、U0126可以顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的ERK1/2蛋白活化，SB203580能夠顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的p38蛋白活化，但瘦素對(duì)JNK蛋白的磷酸化無(wú)影響。PD98059、U0126、SB203580都可以抑制瘦素誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1αmRNA的表達(dá)，SP600125對(duì)瘦素誘導(dǎo)的TNF-

9、α、IL-1αmRNA表達(dá)無(wú)影響。 Ⅱ脂聯(lián)素對(duì)瘦素誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1αmRNA表達(dá)以及MAPK通路活化的影響將不同濃度的脂聯(lián)素(0.32-2.5μg/ml)與PM培養(yǎng)18h，然后再加入75ng/ml的瘦素處理2h。脂聯(lián)素預(yù)處理能夠顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的ERK1/2、p38蛋白磷酸化和TNF-α、IL-1αmRNA表達(dá)(P＜0.01)，而對(duì)JNK蛋白的磷酸化水平無(wú)影響。 Ⅲ瘦素、脂聯(lián)素對(duì)p38、ERK1/2信號(hào)通路的作

10、用在小鼠PM中預(yù)先加入PD98059、U0126或SB203580培養(yǎng)1h，或用脂聯(lián)素(2.5μg/ml)預(yù)處理18h，再加入瘦素(75ng/ml)培養(yǎng)2h，瘦素能夠誘導(dǎo)c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、P90RSK、Elk-1蛋白的磷酸化，PD98059、U0126預(yù)處理能夠抑制瘦素誘導(dǎo)的MEK1/2活化，但對(duì)瘦素誘導(dǎo)的c-Raf的活化無(wú)影響。脂聯(lián)素預(yù)處理能夠顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的c-Raf蛋白磷酸化以及下游的MEK1/2、ERK1

11、/2、P90RSK、Elk-1蛋白的活化表達(dá)。脂聯(lián)素預(yù)處理能夠抑制瘦素誘導(dǎo)的p38信號(hào)通路的活化，SB203580預(yù)處理能夠顯著抑制瘦素引起的p38、HSP27、MAPKAPK-2以及Elk-1、ATF-2的磷酸化，而對(duì)MKK3/MKK6的活化無(wú)影響。PD98059、U0126、SB203580或脂聯(lián)素均能夠顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1αmRNA表達(dá)，PD98059與SB203580或U0126與SB203580聯(lián)合作用，其降

12、低TNF-α、IL-1αmRNA表達(dá)的作用比單獨(dú)使用PD98059、U0126或SB203580顯著。 Ⅳ瘦素、脂聯(lián)素對(duì)cAMP-PKA信號(hào)通路的作用小鼠PM預(yù)先與25μM的RpcAMPS或10μM的H89培養(yǎng)1h，然后加入75ng/ml的瘦素作用2h，或者，體外培養(yǎng)的小鼠PM與抗脂聯(lián)素抗體共育1h后再加入2.5μg/ml的脂聯(lián)素培養(yǎng)18h。瘦素可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度和PKA的活性，這一作用可被RpcAMPS或H89抑

13、制。脂聯(lián)素也能夠增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度和PKA的活性，抗脂聯(lián)素的抗體能夠顯著抑制脂聯(lián)素誘導(dǎo)的cAMP增加和PKA活化。RpcAMPS、H89均能夠顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1αmRNA表達(dá)(P＜0.01)。 在小鼠PM中預(yù)先加入200U/ml的catalase或SOD作用1h，再加入75ng/ml的瘦素培養(yǎng)2h。catalase或SOD對(duì)瘦素誘導(dǎo)的cAMP濃度增加無(wú)影響，對(duì)PKA的活化也沒(méi)有影響(P＞0.05)。

14、 Ⅴ活性氧系列(ROS)在瘦素作用于p38、ERK1/2活化及其在脂聯(lián)素抑制p38、ERK1/2磷酸化中的作用在體外培養(yǎng)的小鼠PM中預(yù)先加入200U/ml的catalase或SOD作用1h，或者與25μM的RpcAMPS或10μM的H89培養(yǎng)1h，或加入2.5μg/ml的脂聯(lián)素培養(yǎng)18h后，再加入瘦素(75ng/ml)作用2h。瘦素能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)H2O2的量，catalase、RpcAMPS、H89或脂聯(lián)素均能夠顯著降低瘦素誘導(dǎo)

15、的H2O2增加，SOD、RpcAMPS、H89或脂聯(lián)素均能夠顯著降低瘦素誘導(dǎo)的O2-增加。catalase、SOD、RpcAMPS、H89或脂聯(lián)素均能顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的ERK1/2、p38蛋白磷酸化和TNF-α、IL-1αmRNA表達(dá)(P＜0.01)。 總結(jié)：1瘦素可以誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-1α，脂聯(lián)素可以拮抗瘦素誘導(dǎo)的小鼠PM表達(dá)炎性因子TNF-α、IL-1α。 2瘦素能夠激活小鼠PM中cAMP-P

16、KA通路，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)系統(tǒng)中的ERK1/2信號(hào)通路(包括c-Raf、MEK1/2、ERK1/2、P90RSK和Elk-1信號(hào)蛋白)或p38信號(hào)通路(包括MKK3/MKK6、p38、MAPKAPK-2、HSP27、Elk-1和ATF-2信號(hào)蛋白)，從而發(fā)揮促炎作用。脂聯(lián)素雖然能夠活化cAMP-PKA，但是其主要作用表現(xiàn)為直接抑制MAPK信號(hào)通路中各信號(hào)蛋白的活化而實(shí)現(xiàn)其抗炎作用。 3瘦素通過(guò)激活cAMP-PKA引起小鼠PM