殼寡糖對巨噬細(xì)胞IL-1β、TNF-α基因表達(dá)的影響.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文殼寡糖對巨噬細(xì)胞IL1β、TNFα基因表達(dá)的影響姓名：張小邊申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)和分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：趙魯杭2002.5.1浙江大學(xué)碩上學(xué)位淪丈胞作為研究對象，通過體外實(shí)驗(yàn)將殼寡糖作用于巨噬細(xì)胞，運(yùn)用相對定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)技術(shù)，檢測對巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子IL一1B、TNF—n基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響。f提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并培養(yǎng)使貼壁生長后，巨噬細(xì)胞實(shí)

2、驗(yàn)組中加入含＼、一定濃度殼寡糖的培養(yǎng)液，巨噬細(xì)胞對照組則只加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收集實(shí)驗(yàn)組和對照組上清培養(yǎng)液留待ELISA實(shí)驗(yàn)用，巨噬細(xì)胞通過異硫氰酸胍一酚一氯仿一步法提取總RNA。由于“管家基因”B—actin表達(dá)穩(wěn)定，其表達(dá)量比細(xì)胞因子基因高，所以相對定量RT—PCR實(shí)驗(yàn)中，13一actincDNA的PCR引物量設(shè)為兩種細(xì)胞因子基因cDNA引物量的一半，確保B—actin和細(xì)胞因子產(chǎn)物量比較均勻。另外，對三種基因cDNA進(jìn)行P

3、CR擴(kuò)增動力學(xué)分析后，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)確定為30，此時三種cDNA都處于指數(shù)擴(kuò)增期，確?？梢杂肂—aCLin擴(kuò)增產(chǎn)物量作為細(xì)胞因子PCR產(chǎn)物量的參比標(biāo)準(zhǔn)，從而可以對細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較。為r明確殼寡糖對巨噬細(xì)胞作用的最適濃度，首先通過RT—PCR確定作用最適濃度范圍為5～fiOug／ml。在此范圍內(nèi)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20～40ug／ml的殼寡糖能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞lL113和TNF—a基因轉(zhuǎn)錄，效應(yīng)有劑量依賴性。選定20ug／ml濃度的殼寡糖繼

4、續(xù)作用于巨噬細(xì)胞，RT—PCR結(jié)果表明可以明顯提高兩種細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)驗(yàn)組IL一1p和TNF—o基因轉(zhuǎn)錄量為對照組的19倍左右(p001)：E1ISA實(shí)驗(yàn)顯示，兩種細(xì)胞因子分泌也顯著增多，實(shí)驗(yàn)組II一1B和TNI。a量分別為對照組的24倍和2倍左右(P001)，說明I，一殼寡糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞兩種細(xì)胞因子基閡翻譯成蛋白質(zhì)／∥本實(shí)驗(yàn)表明，殼寡糖可以增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞IL—lp及TNF—n的基凼表達(dá)，使兩種細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平增高