白藜蘆醇在血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物利用特點(diǎn)和抗炎機(jī)制研究.pdf

1、心腦血管疾病已經(jīng)成為人類(lèi)死亡的首要原因,動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ),不健康的生活方式特別是不合理的膳食結(jié)構(gòu)與AS發(fā)生密切相關(guān)。AS是一個(gè)多因素、多階段的病理過(guò)程,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。目前較公認(rèn)AS為一種慢性炎癥性疾病,炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段,而始于內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷。因此,減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷已經(jīng)成為防治AS的重要途徑。大量研究發(fā)現(xiàn)植物性食物攝入與多種慢

2、性代謝性疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān),而其健康效應(yīng)的功效成分主要是植物化學(xué)物(phytochemicals)。植物化學(xué)物種類(lèi)繁多,包括多酚、胡蘿卜素、皂甙、含硫化合物等,其中研究最多的是多酚類(lèi)。白藜蘆醇(resveratrol,RSV)是多酚中一類(lèi)重要的化合物,流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)膳食RSV的攝入與心血管疾病的發(fā)生顯著負(fù)相關(guān)。然而,RSV抗AS作用的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。一方面,體內(nèi)代謝和生物利用的研究發(fā)現(xiàn),RSV雖然具有較高的腸道吸收率,然而其體內(nèi)

3、清除速率快、半衰期短,導(dǎo)致其生物利用率很低,這與RSV顯著的心血管保護(hù)效應(yīng)形成了明顯的反差,除非存在潛在的血管內(nèi)皮或血管壁組織的有效攝取利用和組織靶向分布。另一方面,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷中起關(guān)鍵作用,RSV是否能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng),以及RSV在細(xì)胞內(nèi)確切的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制,還有待進(jìn)一步研究。
　　本課題利用原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,首先利用RSV的自發(fā)熒光特性,采用熒光分光光度計(jì)、

4、HPLC、LC-MS、激光共聚焦、RNAi等方法明確RSV是否能被內(nèi)皮細(xì)胞攝取利用,并分析時(shí)間、濃度、溫度依賴(lài)的攝取利用特點(diǎn),進(jìn)而探索血清蛋白和SGLT1受體在RSV跨內(nèi)皮細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。在此基礎(chǔ)上,圍繞血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)這一AS發(fā)生發(fā)展的重要誘因,建立TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷模型,利用多種抑制劑、激動(dòng)劑、RNAi、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、電鏡、共聚焦、Westernblot等技術(shù),觀察RSV對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響,并進(jìn)一步明確RSV對(duì)c

5、AMP-PKA-AMPK-SIRT1信號(hào)通路的影響,深入揭示RSV抑制內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)RSV能夠被內(nèi)皮細(xì)胞攝取利用,主要分布于細(xì)胞漿,并在大鼠動(dòng)脈壁存在持久分布特征。
　　(2)RSV能夠通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)兩種方式進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞;被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)受到血清蛋白尤其是白蛋白的影響,而主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)依賴(lài)于SGLT1受體。
　　(3)RSV能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)

6、胞炎性反應(yīng),主要表現(xiàn)為抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的釋放和炎性介質(zhì)的表達(dá)。
　　(4)自噬在RSV抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。RSV能以劑量和時(shí)間依賴(lài)方式增加內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平,自噬被抑制后,RSV的抗炎作用被顯著削弱。
　　(5)SIRT1相關(guān)信號(hào)通路在RSV誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用。RSV能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞cAMP的含量,從而促進(jìn)PKA表達(dá),激活A(yù)MPK,進(jìn)而增加SIRT1表達(dá);而抑制AC、PKA、A

7、MPK、SIRT1活性或采用RNAi沉默AC、PKA、AMPK、SIRT1基因表達(dá)后,RSV誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬被顯著抑制。結(jié)果表明,cAMP-PKA-AMPK-SIRT1信號(hào)通路在介導(dǎo)RSV促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用。
　　綜上所述,RSV能夠被血管內(nèi)皮細(xì)胞有效攝取及存在血管壁持久分布,并通過(guò)活化SIRT1/自噬相關(guān)信號(hào)通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷。
　　植物化學(xué)物的健康促進(jìn)作用的研究已經(jīng)成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),同時(shí)也是藥