利用小分子化合物研究血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和血管生成的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的： 血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)在血管發(fā)育中起重要作用。大量實驗結(jié)果表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的血管功能異常，將引起多種炎癥和退行性疾病的發(fā)生。這些重大疾病嚴(yán)重危害人類健康，如何防治這些疾病是目前亟待解決的問題。 新血管形成(angiogenesis)在生理過程(如胚胎發(fā)育)和病理過程(如腫瘤生長、動脈粥樣硬化)中都起到關(guān)鍵作用。新血管形成與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是促進(jìn)新血管形成的關(guān)鍵因素，

2、但是兩者關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制目前尚未搞清。 從化學(xué)遺傳學(xué)的角度，利用小分子化合物可以發(fā)現(xiàn)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和血管形成的新關(guān)鍵因子，因此可為闡明上述科學(xué)問題提供實驗證據(jù)。先前的研究證明去除血清和生長因子可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凋亡，在此條件下，6-氨基-2,3-二氫-3-羥甲基-1-4-苯并口惡嗪衍生物(ABO)能提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，因此推斷ABO可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制劑和血管形成促進(jìn)劑。 本論文研究目的

3、是從化學(xué)遺傳學(xué)角度，以小分子化合物ABO為工具，研究血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血管形成以及兩者關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。為血管退行性重大疾病的防治提供新線索和靶點。 已知細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)(redox)在細(xì)胞凋亡和血管形成中起重要作用，參與redox的成分包括：線粒體、活性氧(ROS)、NADPH氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)以及一氧化氮(NO)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)等。因此，本論文首先研究了ABO對redox信號分子的調(diào)節(jié)機(jī)制。隨

4、后研究了在ABO的作用下，其它與凋亡和成血管密切相關(guān)的分子(如：磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)、P53、膜整連蛋白β4、核因子κB(NF-κB)以及H-ras)的變化情況。 研究內(nèi)容： 1.ABO抑制去除血清和生長因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用2.ABO促進(jìn)血管生成的作用3.ABO抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成的分子機(jī)制研究 研究方法：1.血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的提取和培養(yǎng)參考Jaffe

5、 EA et al的方法[Jaffe EA et al，1973]2.細(xì)胞凋亡檢測：1)MTT檢測細(xì)胞存活率2)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化3)吖啶橙染色結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡，觀察細(xì)胞核凝集及片斷化4)TUNEL方法，檢測細(xì)胞凋亡率3.體外血管形成檢測：Matfigel方法，參考[Kureishi Y et al，2000]4.體內(nèi)血管形成檢測：雞胚尿囊膜(CAM)方法，參考[Ribatti et al，1997]5.體外細(xì)胞遷移

6、檢測：平面單層細(xì)胞損傷愈合實驗，結(jié)合倒置相差顯微鏡觀察，參考[Bürk，1973；Vasvaxi et al，2007]6.線粒體膜電位(MMP)檢測：利用熒光探針(TMRM)并結(jié)合激光掃描共聚焦顯微術(shù)檢測，參考[Falchi et al，2005]7.ROS檢測：利用熒光探針(DCHF)并結(jié)合激光掃描共聚焦顯微術(shù)檢測8.NADPH氧化酶活性檢測：參考Li et al的方法[Li et al，2002]9.SOD活性檢測：利用SOD檢測

7、試劑盒10.NO含量檢測：利用NO檢測試劑盒11.eNOS活性檢測：利用eNOS檢測試劑盒12.PC-PLC活性檢測：參考吳興中等人的方法[Wu et al，1997]13.細(xì)胞內(nèi)蛋白分布及表達(dá)水平檢測： 1)免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合激光掃描共聚焦顯微術(shù)，檢測P53和NF-κB蛋白的表達(dá)水平及分布2)Western blot方法，檢測P53、膜整連蛋白β4和H-ras蛋白的表達(dá)水平研究結(jié)果1.ABO抑制去除血清和生長因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮

8、細(xì)胞凋亡在去除血清和FGF-2的條件下，ABO(50-200μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24h，HIYVEC的存活率明顯升高(圖2，p＜0.05)，其最佳濃度為50μM，因此在以下研究中均用該濃度處理血管內(nèi)皮細(xì)胞。用ABO處理細(xì)胞12和24h，凋亡小體明顯減少(圖3)；吖啶橙染色和TUNEL染色結(jié)果表明，ABO明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(圖4和圖5，p＜0.05)。 2.ABO促進(jìn)血管生成2.1體外Matrigel毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成實驗

9、結(jié)果表明，在去除血清和FGF-2的條件下，ABO以時間依賴的方式(24-96h)明顯促進(jìn)血管生成(圖6，p＜0.01)；存在FGF-2(70ng/mL)的條件下，ABO和FGF-2可協(xié)同促進(jìn)血管生成(圖7)；僅有存在血清(20％，v/v)的條件下，ABO不能促進(jìn)血管生成(圖8)；血清(20％，v/v)和FGF-2(70ng/mL)都存在的條件下，在培養(yǎng)后期，ABO促進(jìn)血管生成(圖9)。 2.2體內(nèi)雞胚尿囊膜血管形成實驗顯示，AB

10、O(20nmol/100μL)促進(jìn)血管網(wǎng)形成(圖10，p＜0.05)。 2.3單層細(xì)胞損傷愈合實驗結(jié)果顯示，ABO以時間依賴的方式(6-24 h)顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移(圖11，p＜0.01)。 3.ABO抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成的分子機(jī)制3.1用ABO處理細(xì)胞12和24 h，可以明顯降低線粒體膜電位(圖12和圖13，p＜0.05)和細(xì)胞內(nèi)ROS水平(圖14和圖15，p＜0.05)。 3.2用ABO處理細(xì)胞1

11、2h，可以明顯降低NADPH氧化酶(圖16，p＜0.05)和PC-PLC的活性(圖19，p＜0.05)，但對SOD的活性沒有影響(圖17，P＞0.05)。 3.3用ABO處理細(xì)胞12h，明顯增強(qiáng)eNOS的活性(圖18B，p＜0.05)并增加NO含量(圖18A，p＜0.05)，但是處理6和24h，eNOS的活性和NO釋放量沒有變化(圖18)。 3.4免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果表明，用ABO處理細(xì)胞6和12h，NF-kB在細(xì)胞質(zhì)中

12、均勻分布，未觀察到NF-kB的核移位現(xiàn)象(圖23)；用ABO處理細(xì)胞24 h，明顯抑制P53蛋白的表達(dá)并阻止了P53的核移位(圖20，p＜0.05)。 3.5 Western Blot檢測結(jié)果表明，用ABO處理細(xì)胞24h，明顯抑制P53蛋白(圖21B，p＜0.05)和膜整連蛋白β4的表達(dá)(圖22B，p＜0.05)，但是用ABO處理12h，P53和膜整連蛋白β4的表達(dá)均沒有變化(圖21A和圖22A，p＞0.05)。用ABO處理細(xì)胞12和2

13、4h，均明顯抑制H-ras蛋白的表達(dá)(圖24，p＜0.05)。 結(jié)論： 1.ABO明顯抑制去除血清和生長因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 2.ABO有效促進(jìn)血管生成。 3.在去除血清和生長因子的條件下，ABO通過穩(wěn)定線粒體膜電位，防止超極化，維持線粒體的功能，同時通過降低NADPH氧化酶的活性，抑制了細(xì)胞內(nèi)過高的ROS水平而有效抑制了細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)了細(xì)胞遷移和血管生成。此外，ABO還通過增強(qiáng)eNOS的活性使