利用代謝工程手段改善乳酸乳球菌脅迫抗性的研究.pdf

1、江南大學博士學位論文利用代謝工程手段改善乳酸乳球菌脅迫抗性的研究姓名：傅瑞燕申請學位級別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導教師：陳堅20060301江南大學博士學位論文利用代謝工程手段改善乳酸乳球菌脅迫抗性的研究的降低。然而，源自丙酮酸的次要代謝產物，如異戊醇、苯乙醇和苯乙胺的產量至少比乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)高10倍。3Ⅲ轡基因的本底表達可以顯著增加乳酸乳球菌NZ9000對氧脅迫的抗性。處于對數(shù)中期的乳酸乳球菌Nz9000(pF

2、L010)經H202脅迫(50mm01Lf，80min)和甲萘醌(20H1H10lL‘f，80m曲)脅迫后的存活率分別是乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)的837倍和178^倍。并進一步發(fā)現(xiàn)MTG具有在體外直接清除H202和02一的微弱的抗氧化活性。同時，MTG的交聯(lián)反應產物沒有清除H202的作用。4m轡基因的本底表達能夠增強乳酸乳球菌Nz9000對酸脅迫的抗性。在pH25的條件下脅迫15mill、30miIl和45miIl后，處

3、于對數(shù)前期的乳酸乳球菌Nz9000(pFL010)的存活率分別是乳酸乳球菌Nz9000(pNZ8148)的16倍、2_2倍和39倍。但是，處于穩(wěn)定期的乳酸乳球菌Nz9000(pFLOlO)對酸脅迫的抗性反而比乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)弱。可能的原因是較高的pH。。會抑制乳酸乳球菌Nz9000自身酸脅迫誘導型的抗酸脅迫機制的活性。5在高致死率的脅迫條件下，GSH可以增強乳酸乳球菌Nz9000對H202和甲萘醌所引發(fā)氧脅迫的抗

4、性。經50mmoIL。1H202脅迫15min后，處于對數(shù)中期的具有GsH合成能力的乳酸乳球菌Nz9000(pNz3203)的存活率是乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)的12倍：而經l50mmol一H202脅迫15min后，乳酸乳球菌Nz9000(pNz3203)的存活率是乳酸乳球菌Nz9000fpNz8148)的26倍。經20mmolL。1甲萘醌脅迫60min后，處于對數(shù)中期的乳酸乳球菌Nz9000(pNZ3203)存活率是乳酸

5、乳球菌Nz9000(pNz8148)的62倍。6通過構建具有GsH合成能力的乳酸乳球菌NZ9000的超氧化物歧化酶(SodA)突變株乳酸乳球菌Nz4504(pNz3203)，發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌NZ9000自身氧脅迫抗性被削弱的條件下，在宿主菌抵抗氧脅迫中，GsH可以表現(xiàn)出更強的保護作用。GSH可以減輕30umolL。1甲萘醌脅迫給乳酸乳球菌Nz9000的sodA缺失突變株乳酸乳球菌Nz4504帶來的生長抑制。經50mmolL。1H202脅

6、迫45min后，處于對數(shù)前期的乳酸乳球菌Nz4504(pNz3203)存活率是對照菌乳酸乳球菌Nz4504(pNZ8148)的108倍。7通過構建具有GSH合成能力的乳酸乳球菌SKll(pNZ9530／pNz3203)，發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌SKll中生產GSH可以顯著提高宿主菌的好氧生長性能和pH。。。乳酸乳球菌SKll(pNZ9530／pNz3203)在M17培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基中好氧生長的最高生物量(OD600)分別為609士002和64