利用代謝工程構(gòu)建高產(chǎn)番茄紅素大腸桿菌.pdf

1、番茄紅素是迄今發(fā)現(xiàn)的各種類胡蘿卜素中抗氧化性最強(qiáng)的一種，可以保護(hù)細(xì)胞和組織免受自由基和單線性氧的損害，也可以增強(qiáng)人體的免疫反應(yīng)。研究表明，番茄紅素和降低患動(dòng)脈硬化癥、冠心病以及包括肺癌、膀胱癌、宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌在內(nèi)的各種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)存在一定的聯(lián)系。因此，番茄紅素在食品和藥品等領(lǐng)域具有重大的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。近年來，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素成為研究熱點(diǎn)，特別是利用代謝工程實(shí)現(xiàn)了番茄紅素在大腸桿菌中的異源表達(dá)，并得到較高的產(chǎn)量。

2、>　　 本文利用代謝工程的方法構(gòu)建了高產(chǎn)番茄紅素的大腸桿菌工程菌：主要利用基因敲除、過量表達(dá)相關(guān)的基因和選用合適的表達(dá)載體等手段來實(shí)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)使用0.5％乙酸鉀作為碳源發(fā)酵效果最好。
　　 從七種大腸桿菌中選擇BW25113作為基因敲除的起始菌，利用Red重組系統(tǒng)分別對(duì)gdhA、fdhF和aceE這三個(gè)基因進(jìn)行敲除，獲得了4種不同基因敲除組合的重組菌株。發(fā)酵結(jié)果表明，△g△a和△g△f△a這兩種突變菌株最好。
　　 從質(zhì)

3、粒pAC-LYCO4中擴(kuò)增crtE、crtI、crtB和ipi基因，加上idi、dxs、rpoS基因，利用誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pBAD24和構(gòu)建的組成型表達(dá)質(zhì)粒pACYC315以及pACYC316，總共構(gòu)建了19種表達(dá)質(zhì)粒。從這些質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)pAC315-WZM4F、pAC316-WZM3R和pAC316-WZM4R這三種質(zhì)粒最好。三種高產(chǎn)番茄紅素質(zhì)粒和基因敲除菌株△g△a、△g△f△a結(jié)合后發(fā)現(xiàn)△g△a/pAC316-WZM4R為最佳組合。△

4、g△a/pAC316-WZM4R在2YT-KAc(0.5％)的發(fā)酵培養(yǎng)基中番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到12mg/gDCW以上，比起始菌BW25113/pAC-LYCO4的2～3mg/gDCW提高了大約4倍。隨后發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中使用國產(chǎn)細(xì)菌學(xué)蛋白胨比進(jìn)口的胰蛋白胨效果更好。△g△a/pAC316-WZM4R能夠在使用國產(chǎn)細(xì)菌學(xué)蛋白胨的2YP-KAc(0.5％)發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)14mg/gDCW以上的番茄紅素，而△g△aT5/pAC316-WZM4R則

5、能夠產(chǎn)15mg/gDCW以上的番茄紅素。
　　 過量表達(dá)csrB也能夠在△g△a/pAC316-WZM4R的基礎(chǔ)上提高番茄紅素的產(chǎn)量，但無法在△g△aT5/pAC316-WZM4R的基礎(chǔ)上提高番茄紅素產(chǎn)量。
　　 還利用XL1-Red致突變菌株對(duì)pAC-LYCO4質(zhì)粒和易錯(cuò)PCR方法對(duì)crtE、crtI、crtB進(jìn)行了隨機(jī)突變，但均無法得到番茄紅素產(chǎn)量提高的突變子。同時(shí)將△g△a的gapA基因替換為丙酮丁醇梭菌的gapC