MAGE-A3基因的過表達(dá)對人肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:將攜帶MAGE-A3基因的慢病毒表達(dá)載體感染人肝癌細(xì)胞株HepG2及MHCC-97H，觀察慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的MAGE-A3基因的過表達(dá)對人肝癌細(xì)胞HepG2及MHCC-97H增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布、侵襲及遷移的影響，探討MAGE-A3基因的生物學(xué)功能及在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為臨床尋找新的治療策略奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將已構(gòu)建的MAGE-A3重組慢病毒表達(dá)載體感染 HepG2、MHCC-97H細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分三組，無感

2、染組（對照組）、空載體病毒感染組（LV-PGCFU-GFP組）、MAGE-A3重組病毒感染組(LV-MAGE-A3組)，倒置熒光顯微鏡觀察感染效率，RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測MAGE-A3在肝癌中的表達(dá)情況；MTT技術(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MAGE-A3基因過表達(dá)前后HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的生長增殖、遷移及侵襲能力的變化；原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記 DNA鏈斷端分析法（

3、terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp-biotin nick end-labeling assay, TUNEL）檢測HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的凋亡情況，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）分析HepG2、MHCC-97H細(xì)胞周期的改變。
　　結(jié)果：
　　1.病毒感染細(xì)胞后72h，倒置熒光顯微鏡可觀察到微量熒光表達(dá)，120h熒光達(dá)

4、到最強(qiáng)且穩(wěn)定，感染效率可達(dá)80％。RT-PCR和WesternBlot證實(shí)經(jīng)LV-MAGE-A3感染的細(xì)胞高效表達(dá)MAGE-A3基因與蛋白。
　　2.經(jīng)MTT檢測及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)LV-MAGE-A3感染組與無感染組和空載體病毒感染組相比體外生長增殖能力無明顯區(qū)別（P>0.05）。
　　3.經(jīng)TUNEL技術(shù)檢測HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)LV-MAGE-

5、A3感染組與無感染組及空載體病毒感染組相比細(xì)胞凋亡指數(shù)無明顯區(qū)別（P>0.05）。
　　4.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，在LV-MAGE-A3感染組，HepG2、MHCC-97H細(xì)胞的的遷移細(xì)胞數(shù)分別為（187±13.52）、（121±4.16），明顯高于無感染組及空載體病毒感染組遷移細(xì)胞數(shù)（HepG2, P=0.001, P=0.037;MHCC-97H,P=0.000,P=0.000）。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，在LV-MAGE-A3感染組，Hep

6、G2、MHCC-97H細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（164.00±9.64)、(59.5±1.00)，明顯高于無感染組及空載體病毒感染組侵襲細(xì)胞數(shù)（P值均為0.000）。
　　5. FCM分析HepG2、MHCC-97H細(xì)胞周期，結(jié)果顯示MAGE-A3的過表達(dá)可影響人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布，觀察到兩株細(xì)胞處于 S期細(xì)胞比例明顯增加，G1期細(xì)胞比例減少。表明HepG2、MHCC-97H細(xì)胞經(jīng)LV-MAGE-A3感染后進(jìn)入增殖期細(xì)胞比例提