2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的常見(jiàn)原因。跨核膜抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf1(nuclear factor-erythroid2 p45 submit-related factor1)是Cnc-bZIP(cap‘n’collar basic-region leucinezipper)即Cnc堿性亮氨酸拉鏈亞家族成員之一,通過(guò)調(diào)控下游抗氧化酶、解毒酶、26s蛋白酶體亞基基因的轉(zhuǎn)錄,保

2、護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化應(yīng)激的影響,引發(fā)細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性變化以維持機(jī)體內(nèi)平衡。研究證實(shí)在成年小鼠肝臟特異敲除Nrf1會(huì)誘發(fā)肝細(xì)胞癌[1,2]。
  O連接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)單糖修飾是細(xì)胞為滿足不同生物學(xué)功能需要,進(jìn)行的快速、可逆、動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,由體內(nèi)的唯一的O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc Transferase, OGT)催化進(jìn)行。O-

3、GlcNAc修飾的異常與腫瘤發(fā)生、遷移和侵襲過(guò)程密切相關(guān),在肝細(xì)胞癌形成和發(fā)展中起著重要作用[3]。近期液相色譜-光譜法檢測(cè)提示,OGT可以與Nrf1蛋白相互作用,因此,探討糖蛋白Nrf1和O-GlcNAc修飾的關(guān)系,以及O-GlcNAc修飾對(duì)Nrf1生物學(xué)功能及Nrf1在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中作用的影響,將為Nrf1缺失誘發(fā)HCC發(fā)病機(jī)理、臨床病理聯(lián)系及預(yù)后判斷提供新的思路。
  研究方法與結(jié)果:
 ?、偾脺phNrf1/TCF

4、11對(duì)人肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
  我們首先用Western Blot檢測(cè)hNrf1/TCF11在人正常肝細(xì)胞HL-7702及不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)hNrf1/TCF11在人正常肝細(xì)胞HL-7702中高表達(dá),而在不同肝癌細(xì)胞系中hNrf1/TCF11的表達(dá)較低。接下來(lái)構(gòu)建hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒載體,篩選出沉默 hNrf1/TCF11最有效的shRNA靶序列為:ACAACCTGAGG AATACCTT。利用

5、構(gòu)建好的hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒載體及Negative control shRNA空載質(zhì)粒病毒載體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L,建立穩(wěn)定敲減hNrf1/TCF11細(xì)胞系,分別命名為shNrf1實(shí)驗(yàn)組和shNC陰性對(duì)照組。
  MTT、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀測(cè)細(xì)胞增殖情況,結(jié)果均顯示在HepG2細(xì)胞中敲減hNrf1可促進(jìn)細(xì)胞增殖,而在另外兩株肝癌細(xì)胞shNrf1-MHCC97H、shNrf1

6、-MHCC97L與對(duì)照株shNC間無(wú)明顯差異。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡,結(jié)果提示,實(shí)驗(yàn)組(shNrf1)細(xì)胞出現(xiàn)了G2/M期停滯,而僅在HepG2細(xì)胞敲減hNrf1后細(xì)胞早期凋亡率明顯增加(p<0.05),而在其他兩株肝癌細(xì)胞中未見(jiàn)明顯變化。
  最后我們用細(xì)胞劃痕體外遷移實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力,結(jié)果顯示在HepG2、MHCC97H、MHCC97L中敲減hNrf1(shNrf1-)后遷移及

7、侵襲能力均較對(duì)照組(shNC-)明顯增強(qiáng)(p<0.05)。
 ?、谇脺phNrf1/TCF11對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲影響的機(jī)制研究
  用Real-time PCR檢測(cè)shNrf1-HepG2中與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著升高,CDH1表達(dá)顯著下調(diào)(p<0.05)。Western Blot檢測(cè)各株shNrf1實(shí)驗(yàn)組和shNC陰性對(duì)照組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin及MMP-9的表達(dá)量,

8、結(jié)果再次證實(shí)敲減hNrf1/TCF11使肝癌細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。
  對(duì)shNrf1-HepG2細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序,結(jié)果進(jìn)行信號(hào)通路聚類分析發(fā)現(xiàn),有效敲減hNrf1后HepG2細(xì)胞β-Catenin通路被激活。TOP/FOP Flash實(shí)驗(yàn)顯示,沉默hNrf1能顯著激活β-Catenin的轉(zhuǎn)錄活性(p<0.01),Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲減hNrf1時(shí)β-Catenin及其調(diào)控的下游靶基因Cyclin D1

9、、c-Myc、MMP-7蛋白表達(dá)均增加。
  放線菌酮蛋白追蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與shNC-HepG2組相比shNrf1-HepG2細(xì)胞內(nèi)-Catenin半壽期延長(zhǎng),蛋白穩(wěn)定性增加。Western blot檢測(cè)細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)-Catenin的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),敲減hNrf1時(shí)細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)活化的β-Catenin累積,而且易位入核的活性β-Catenin增加,而胞核內(nèi)易被降解的磷酸化的β-Catenin明顯減少。coIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hN

10、rf1時(shí),β-Catenin的泛素化降解增強(qiáng)。最后通過(guò)建立裸鼠人肝癌肺轉(zhuǎn)移瘤模型,在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證hNrf1/TCF11對(duì)人肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)shNrf1組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量、結(jié)節(jié)體積均明顯大于shNC組。免疫組化染色法檢測(cè)模型鼠中肝臟β-Catenin的表達(dá),結(jié)果shNrf1實(shí)驗(yàn)組hNrf1/TCF11表達(dá)減少而β-Catenin累積增加。肺部轉(zhuǎn)移瘤中shNrf1組β-Catenin及其下游基因Cyclin D1的蛋白

11、表達(dá)量較shNC組明顯增高。Real-time PCR、Western blot檢測(cè)兩組模型鼠肝臟hNrf1/TCF11、E-cadherin、β-Catenin及其下游基因Cyclin D1、c-Myc、MMP7表達(dá),結(jié)果shNrf1實(shí)驗(yàn)組hNrf1/TCF11表達(dá)減少,E-cadherin mRNA水平變化不明顯,但蛋白表達(dá)顯著下調(diào),β-Catenin及其下游基因Cyclin D1、c-Myc、MMP7表達(dá)均不同程度增加。
 

12、 ③O-GlcNAc修飾對(duì)Nrf1的影響
  Western blot檢測(cè)HEK293T細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc水平及hNrf1/TCF11的豐度。結(jié)果顯示,在低糖培養(yǎng)基(G5)中加入OGT特異抑制劑Alloxan(100 M),細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc水平顯著下降,hNrf1/TCF11豐度顯著增加;相反高糖培養(yǎng)基(G25)中加入OGA抑制劑PUGNAc(50 M),細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc水平提高,hNrf1/T

13、CF11豐度下降。
  GST-Pull Down、coIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)OGT與Nrf1在體外、細(xì)胞內(nèi)均能相互作用,并且兩者在細(xì)胞內(nèi)的相互作用受GlcNH2影響。
  合成siRNA并經(jīng)real-time PCR、Western blot驗(yàn)證篩選出能有效干涉OGT表達(dá)的siOGT-1序列為:sense5’-GGAGCCUUGCAGUGUUAUA-3’,Anti-sense5’-UAUAACACUGCAAGGCUCC-3’,ARE

14、-熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,干涉OGT時(shí)Nrf1的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。Western blot分析顯示siOGT-1敲減OGT時(shí),內(nèi)源性的Nrf1及其下游靶基因Lipin1和GCLM的蛋白表達(dá)均有明顯增加。相反,過(guò)表達(dá)OGT蛋白時(shí),細(xì)胞內(nèi)由OGT催化的總的O-GlcNAc修飾蛋白較對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)增加而內(nèi)源性的Nrf1蛋白表達(dá)減少,Nrf1調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性減弱。
  coIP實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)OGT時(shí)能增加Nrf1的泛素化,同時(shí)在G2

15、5培養(yǎng)條件下過(guò)表達(dá)OGT,能增加底物Nrf1降解;相反在低糖培養(yǎng)基(G5)中過(guò)表達(dá)OGT,細(xì)胞內(nèi)的Nrf1的降解減少,此時(shí)Nrf1的表達(dá)量明顯高于高糖時(shí)。而當(dāng)轉(zhuǎn)染Nrf1、OGT(ΔTPR1-6)時(shí)Nrf1的表達(dá)量明顯高于共轉(zhuǎn)染Nrf1、OGT組。放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)顯示在干涉OGT時(shí),Nrf1蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)。最后我們用Nrf1不同截短體與OGT共轉(zhuǎn)染,Western blot分析顯示Nrf1進(jìn)行O-GlcNAc修飾的區(qū)域位于PEST2序列

16、富含絲氨酸的區(qū)段。
  結(jié)論:
 ?、僭谌烁伟┘?xì)胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L成功建立穩(wěn)定敲減hNrf1/TCF11的shNrf1實(shí)驗(yàn)組和shNC陰性對(duì)照組細(xì)胞株。
 ?、趆Nrf1/TCF11基因?qū)θ烁渭?xì)胞癌生物學(xué)行為的調(diào)控主要表現(xiàn)在敲減hNrf1/TCF11時(shí)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。
 ?、矍脺phNrf1/TCF11時(shí)β-Catenin通路激活。通過(guò)減少β-Catenin磷酸化依賴的泛素化

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