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文檔簡介
1、目的:
1.通過應(yīng)用鉤藤中藥復(fù)方對腎性高血壓大鼠模型的干預(yù),研究鉤藤復(fù)方對腎性高血壓大鼠血壓和血漿內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、一氧化氮(NO)的影響,以及對動脈組織一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)的影響,探討鉤藤復(fù)方的降血壓機(jī)制。
2.通過研究鉤藤復(fù)方對腎性高血壓大鼠主動脈壁形態(tài)學(xué)及VSMC超微結(jié)構(gòu)的改變和動脈組織中Ⅰ型膠原(CICF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、骨橋蛋白(OPN)
2、含量以及bFGF、OPN mRNA表達(dá)的影響,探討鉤藤復(fù)方抑制高血壓血管重塑的機(jī)制。
3.通過對高血壓的致病機(jī)理的研究,結(jié)合中醫(yī)藥學(xué)相關(guān)理論,在細(xì)胞、分子、基因水平上揭示鉤藤復(fù)方中藥對緩解高血壓癥狀、改善和抑制高血壓的血管重塑及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能方面的生理學(xué)作用機(jī)制,為篩選最佳臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
材料與方法:
1.實(shí)驗(yàn)藥品
(1)鉤藤、天麻、黃芪、丹參、決明子、白芍、牛膝、
3、桑葉。生藥材經(jīng)過再次干燥,按處方比例混合均勻,于常溫下加入蒸餾水浸泡1小時(shí);文火煎煮三次,每次煎煮時(shí)間為1小時(shí);將過濾后的濾出液混合并濃縮,制成每毫升含生藥2克的濃縮液,-4℃冰箱保存。
(2)牛黃降壓丸:1.6克/丸。以蒸餾水配制成0.2克/毫升的藥液,供大鼠灌胃使用。
(3)卡托普利(CAP):25毫克/片。以蒸餾水配制成2.5毫克/毫升的藥液,供大鼠灌胃使用。
2.實(shí)驗(yàn)動物:本實(shí)驗(yàn)采用Go
4、ldblatt經(jīng)典腎性高血壓大鼠模型并加以改進(jìn),建立“兩腎一夾”腎性高血壓大鼠模型(RHR)。
3.分組:實(shí)驗(yàn)動物模型分為6組,每組10只:空白對照組、模型組、鉤藤高劑量組、鉤藤低劑量組、中藥對照組、西藥對照組。
4.方法:鉤藤高劑量組給與20g生藥/kg/d,低劑量組6.6g生藥/kg/d,西藥對照組7.5 mg/Kg/d,中藥對照組0.96g/kg/d,空白對照組及模型組均給予1ml/100g的蒸餾水灌胃
5、。每日上午給藥一次,持續(xù)12周。最后一次給藥后24小時(shí)禁食,不禁水。用10%水合氯醛,按0.4ml/100g的劑量腹腔注射麻醉動物后取材。
5.研究內(nèi)容
(1)腎性高血壓模型的建立與評價(jià);(2)鉤藤復(fù)方對腎性高血壓大鼠血壓的影響;(3)鉤藤復(fù)方對腎性高血壓大鼠血漿ET-1、NO、AngⅡ水平的影響;(4)主動脈壁病理學(xué)觀察,形態(tài)學(xué)指標(biāo):主動脈中膜厚度(MT)、中膜膠原面積檢測及VSMC超微結(jié)構(gòu)觀察;(6)應(yīng)用
6、酶聯(lián)免疫法(Elisa)測定腎性高血壓大鼠動脈組織中CICF、eNOS、bFGF、OPN含量;(7) RT-PCR法檢測腎性高血壓大鼠主動脈壁bFGF、OPN mRNA表達(dá)。
結(jié)果:
1.腎性高血壓模型的建立與評價(jià):與空白對照組比較,手術(shù)組即左側(cè)腎動脈部分狹窄后,“兩腎一夾”高血壓大鼠模型在3天內(nèi)收縮壓開始出現(xiàn)升高,7天后血壓急劇上升,14天高血壓已初步形成,28天時(shí)動脈收縮壓由術(shù)前的(101.80±4.18
7、) mmHg上升到(152.32±4.53) mmHg,具有顯著性差異。
2.鉤藤復(fù)方對RHR大鼠血壓及血中AngⅡ、ET-1、NO含量、動脈組織eNOS活性的影響
(1)鉤藤復(fù)方對腎性RH大鼠血壓的影響:經(jīng)過連續(xù)藥物干預(yù),治療后第3周開始,西藥對照組首先出現(xiàn)血壓降低,與模型組和治療前相比有顯著性差異,其后呈逐漸顯著下降趨勢。其他治療組從第6周開始出現(xiàn)持續(xù)性血壓降低,其中鉤藤高劑量組與治療前和模型組比較有顯著
8、差異,治療9周后鉤藤復(fù)方低劑量組、中藥對照組出現(xiàn)顯著血壓下降。
(2)血漿中AngⅡ含量的比較:與空白對照組大鼠相比,模型組大鼠血漿AngⅡ濃度明顯升高,具有顯著差異。除西藥對照組外,各給藥組大鼠血漿AngⅡ濃度均有顯著升高。各給藥組大鼠除鉤藤低劑量組外血漿AngⅡ濃度均低于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。西藥對照組血漿AngⅡ濃度均高于其它給藥組,且顯著高于低劑量組。
(3)血漿中ET-1含量的比較:與空白對照組相比
9、,模型組和西藥對照組大鼠血漿ET-1濃度明顯增加。除西藥對照組外,各治療組大鼠血漿ET-1濃度較模型組均有顯著下降,其中高劑量組下降最為顯著,其次為低劑量組、中藥對照組。高劑量組與西藥對照組相比,血漿ET-1濃度也明顯降低。
(4)血清NO含量的比較:與空白對照組比較,模型組大鼠血清NO含量明顯低于空白對照組大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組大鼠血漿NO含量與模型組比較均有升高,其中高劑量組升高最為顯著,其次為低劑量組、中藥
10、對照組,西藥對照組與模型組比較雖有升高但無顯著性差異。高劑量組與西藥對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(5)動脈組織中eNOS活性的比較:與空白對照組比較,模型組大鼠主動脈eNOS活性明顯低于空白對照組大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組大鼠eNOS活性與模型組比較均有顯著升高。西藥對照組與模型組比較雖有升高但無顯著性差異。鉤藤高劑量組與西藥對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.鉤藤復(fù)方對腎性高血壓大鼠動脈壁形態(tài)
11、學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及CICF的影響
(1)光鏡下主動脈形態(tài)學(xué)觀察:HE染色切片顯示:模型組與空白對照組相比血管中膜厚度(MT)顯著升高。與模型組相比,各給藥組主動脈中膜厚度均有所降低,高劑量組和西藥對照組中膜厚度降低最顯著。但各治療組間差異無顯著性。
(2)光鏡下Masson染色觀察:染色結(jié)果:大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)經(jīng)Masson染色為淡粉色,細(xì)胞間質(zhì)成分染色紋理界限清晰的淺綠色。分組光鏡結(jié)果顯示:空白對照
12、組大鼠管壁間質(zhì)成分較少呈均質(zhì)狀,血管中膜膠原纖維排列整齊連續(xù)、層次清晰。模型組大鼠與空白對照組比較可見有明顯的間質(zhì)成分增多,血管壁平滑肌層明顯增生紊亂,間質(zhì)增多,膠原纖維排列紊亂,表現(xiàn)為間隙加大、過度迂曲、層次混亂、局部出現(xiàn)斷裂。與模型組相比,各給藥組動脈管壁間質(zhì)成分則有不同程度下降,中膜膠原纖維排列亦較規(guī)整。
(3)主動脈中膜膠原面積百分比(VFC)的比較:模型組大鼠與空白對照組比較,主動脈壁中膜膠原面積百分比顯著升高。
13、與模型組相比,各給藥組主動脈中膜膠原面積百分比顯著減少,其中高劑量組和低劑量組減少最為顯著。
(4)主動脈壁平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察:透射電鏡觀察顯示:空白對照組大鼠主動脈管壁中膜平滑肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核的形態(tài)較規(guī)則,線粒體數(shù)量較少,無變形,嵴規(guī)整。模型組大鼠主動脈VSMC異常增大,局部線粒體數(shù)量明顯增多、個(gè)體腫大、基質(zhì)密度下降,嵴數(shù)量減少、移位、局部出現(xiàn)空泡,細(xì)胞核變形明顯,呈不規(guī)則狀,密度不均勻,染色質(zhì)靠近核內(nèi)膜呈
14、不規(guī)則分布,局部核質(zhì)固縮。其他治療組大鼠主動脈中膜平滑肌細(xì)胞形態(tài)均有不同程度好轉(zhuǎn),與模型組相比,線粒體數(shù)量明顯減少,形態(tài)也較規(guī)則,細(xì)胞核染色質(zhì)均勻分布。
(5)主動脈組織中C1CF含量的比較:與空白對照組大鼠相比,模型組大鼠血管壁C1CF含量明顯升高。與模型組大鼠相比,各給藥組C1CF含量均顯著下降,其中高劑量組下降最為顯著,依次為低劑量組、中藥對照組和西藥對照組。各給藥間無顯著性差異。
4.鉤藤復(fù)方對RHR
15、大鼠動脈組織中bFGF、OPN含量及mRNA表達(dá)的影響
(1)主動脈組織中bFGF含量的比較:與空白對照組大鼠相比,模型組大鼠血管壁bFGF含量明顯升高;實(shí)驗(yàn)后與模型組大鼠相比,各給藥組bFGF含量均有顯著下降;高劑量組下降最為顯著,接近空白對照組,但仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中藥對照組與高劑量組比較亦有顯著差異。
(2)主動脈組織中OPN含量的比較:與空白對照組大鼠相比,模型組大鼠血管壁OPN含量明顯升高。與模型組大
16、鼠相比,實(shí)驗(yàn)各組OPN含量均有顯著下降,高劑量組OPN蛋白含量下降最為顯著;中藥對照組及西藥對照組與高劑量組和低劑量組比較均有顯著差異。
(3)動脈組織中bFGF mRNA表達(dá)的比較:模型組大鼠血管壁bFGF mRNA表達(dá)顯著高于空白對照組。高、低劑量組bFGF mRNA表達(dá)與模型組比較顯著下降;中藥對照組、西藥對照組與模型組相比也有顯著性差異;中藥對照組及西藥對照組mRNA表達(dá)與高劑量組比較有顯著差異。
(
17、4)動脈組織中OPN mRNA表達(dá)的比較:模型組大鼠血管壁OPNmRNA表達(dá)顯著高于空白對照組。高、低劑量組OPN mRNA表達(dá)與模型組比較顯著下降,中藥對照組、西藥對照組與模型組相比也有顯著性差異;中藥對照組及西藥對照組mRNA表達(dá)與高劑量組比較有顯著差異。
結(jié)論:
1.鉤藤復(fù)方對腎性高血壓大鼠模型具有顯著的降壓療效,其降壓機(jī)制可能是通過降低腎性高血壓大鼠血漿AngⅡ、ET-1水平,升高NO的水平及血管內(nèi)皮
18、eNOS的表達(dá),從而改善腎性高血壓大鼠的病理體質(zhì)而發(fā)揮藥效,亦說明鉤藤復(fù)方中藥組方的合理性。
2.鉤藤復(fù)方中藥能夠改善腎性高血壓大鼠主動脈中膜VSMC增殖、遷移改變。其機(jī)制與鉤藤復(fù)方中藥抑制bFGF和OPN對VSMC表型轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用有關(guān)。
3.鉤藤復(fù)方中藥能明顯改善腎性高血壓大鼠主動脈壁形態(tài)學(xué)指標(biāo),降低主動脈中膜膠原含量,對腎性高血壓大鼠主動脈血管重塑進(jìn)程有明顯的抑制作用,其機(jī)制與鉤藤復(fù)方中藥抑制主動脈壁b
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