不同干預(yù)措施對哮喘大鼠免疫耐受的影響.pdf

1、目的：“Th1/Th2偏移”假說是哮喘發(fā)病的主要免疫機(jī)制，但近年的研究發(fā)現(xiàn)該學(xué)說不能完全解釋哮喘的免疫學(xué)異常，提出哮喘是一種對過敏原免疫耐受缺陷性疾患，但尚無系列研究證明這種理論。本研究旨在分別應(yīng)用腹腔注射地塞米松、卵白蛋白（ovalbumin，OVA）特異性免疫治療以及兩者聯(lián)合治療的方法建立哮喘大鼠免疫耐受模型，進(jìn)而探討不同干預(yù)措施重建哮喘大鼠免疫耐受的可能性及其機(jī)制。為臨床上合理選擇哮喘治療方案提供理論依據(jù)。
　　 方法：6

2、0只SPF級(jí)雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為生理鹽水對照組（NS組）、單純哮喘組（A組）、哮喘地塞米松治療組（D組）、哮喘免疫治療組（S組）、地塞米松和免疫治療聯(lián)合干預(yù)組（DS組）。每組均為12只。以卵蛋白腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)制備大鼠哮喘模型。在哮喘模型基礎(chǔ)上，D組在每次激發(fā)前30 min用水溶性地塞米松0.5mg/kg腹腔注射；S組于第33、35、37天在每

3、次激發(fā)前30min分別經(jīng)尾根部皮下注射OVA100mg、200mg、400mg外，其余步驟完全同A組；DS組在每次激發(fā)前30min，腹腔注射地塞米松和尾根部皮下注射OVA，劑量同D組和S組；NS組僅將OVA替換為等量生理鹽水同步注射。采用動(dòng)物肺功能儀檢測各組大鼠氣道呼氣阻力；留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定BALF和血清中IFN-γ、IL-4含量以及OVA特異性IgE（sIgE）的含

4、量；蘇木精-伊紅染色觀察氣道病理改變；免疫組化法測定肺組織T-bet和GATA-3表達(dá)；用流式細(xì)胞儀方法檢測CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例。
　　 結(jié)果：
　　 1.BALF中細(xì)胞組分：NS組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞分別為（41.67±4.14）×105、（2.67±0.98）×105A組分別為（124.83±6.45）×105、（33.08±3.50）×105，D組分別為（69.33±5.01）×105

5、、（6.42±0.90）×105，S組分別為（76.08±4.29）×105、（6.50±0.79）×105，DS組分別為（67.58±5.63）×105、（5.92±1.24）×105，干預(yù)組和哮喘組明顯高于對照組（P<0.05）。D組和DS組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.肺功能及激發(fā)試驗(yàn)情況：同等劑量氯化乙酰膽堿（6.25μg/kg、12.5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg）激發(fā)時(shí)平均呼氣阻力（單位cm H2O·m

6、l-1·s-1），A組分別為（12.50±0.62）、（37.40±0.68）、（65.95±2.37）、（91.11±0.61），NS組分別為（12.52±1.48）、（21.41±1.53）、（36.62±3.67）、（52.64±0.41），D組分別為（13.14±0.14）、（31.63±0.91）、（60.95±2.37）、（66.90±0.50），S組分別為（13.53±0.35）、（32.24±0.78）、（62.03±1

7、.84）、（77.45±1.39），DS組分別為（13.47±0.32）、（29.50±1.23）、（56.47±1.35）、（66.53±0.99）。A組和干預(yù)組大鼠氣道基本阻力高于對照組（P<0.05），經(jīng)靜脈注射乙酰膽堿后A組和干預(yù)組大鼠氣道呼氣阻力變化幅度高于對照組（P<0.05），顯示造模成功。
　　 3.肺組織形態(tài)學(xué)改變：肺組織中嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、支氣管管壁面積/支氣管管腔內(nèi)周長（WA/Pi）和支氣管平滑肌面

8、積/支氣管管腔內(nèi)周長（ASM/Pi），哮喘組明顯高于NS組（P<0.05），與A組比較，D組、S組、DS組上述4項(xiàng)指標(biāo)均減少（P<0.05）。
　　 4.肺組織 T-bet及GATA-3表達(dá)量比例（SP法）：免疫組化顯示，A組、D組、S組、DS組的T-bet表達(dá)量低于NS組（P<0.05）；與A組比較，D組、S組、DS組的T-bet表達(dá)量增加（P<0.05）。GATA-3在A組、D組、S組、DS組的表達(dá)顯著高于NS組，其差異有統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；D組、S組、DS組的GATA-3表達(dá)量和A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），D組和S組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.BALF及血清中IFN-γ、IL-4的含量：A組、D組、S組和DS組BALF及血清中IFN-γ水平均低于NS組（P<0.05），D組中IFN-γ水平則低于A組（P<0.05），S組和DS組較A組顯著增高（P<0.05）；A組、D組、S組和DS組BALF及血清中IL-4水平均高于NS

10、組（P<0.05）；D組、S組和DS組中IL-4水平則低于A組（P<0.05），且S組和DS組較D組降低顯著（P<0.05），S組和DS組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.血清OVA特異性IgE的含量：A組、D組、S組和DS血清sIgE含量均高于NS組（P<0.05），D組、S組和DS組血清sIgE含量均低于A組（P<0.05），血清sIgE含量在D組、S組和DS組兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7.血中CD4+CD25+Fo

11、xp3+T細(xì)胞比例：流式細(xì)胞術(shù)顯示，A組大鼠血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例顯著低于NS組（P<0.05）；D組、S組和DS組大鼠血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例較A組顯著增加（P<0.05），S組和DS組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.免疫耐受的破壞是哮喘發(fā)病機(jī)制之一。其中T淋巴細(xì)胞分化失衡及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能缺失是誘導(dǎo)哮喘發(fā)病的重要因素。
　　 2.地塞米松使哮喘大鼠IFN-

12、γ表達(dá)下調(diào)，對Th2型細(xì)胞因子IL-4更加強(qiáng)烈的抑制，同時(shí)顯著提高血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例，進(jìn)而糾正Th1/Th2失衡。提示地塞米松誘導(dǎo)哮喘大鼠免疫耐受形成的機(jī)制可能與促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加有關(guān)。
　　 3.OVA特異性免疫治療使合成Th2型細(xì)胞因子IL-4減少、Th1型細(xì)胞因子IFN-γ增多，同時(shí)上調(diào)血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例，重建哮喘大鼠免疫耐受。提示OVA特異性免疫治療可誘導(dǎo)原始T細(xì)胞向