BTLA在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎中的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、暴發(fā)性病毒肝炎(Fulminant viral hepatitis，F(xiàn)H)是病毒感染引起的大規(guī)模肝細(xì)胞壞死，嚴(yán)重的肝功能損害、肝性腦病等為特征的臨床綜合癥。常見(jiàn)于中國(guó)及其他HBV流行的亞洲國(guó)家，起病急，死亡率高，缺乏有效的治療手段。尋找有效的治療手段需要我們對(duì)其致病機(jī)制有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，對(duì)MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎模型的研究將有利于我們更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)暴發(fā)性肝炎的發(fā)病機(jī)制，為暴發(fā)性肝炎的臨床治療提供新的理論依據(jù)。
　　 MHV-3

2、是冠狀病毒科的單正鏈RNA病毒，敏感小鼠如Balb/c、C57/BL感染可在肝血竇形成血栓，致肝臟微循環(huán)改變，大量肝細(xì)胞缺血壞死，引起暴發(fā)性病毒肝炎且3-7天死亡，而A/J等耐受小鼠則對(duì)其完全耐受，不表現(xiàn)出任何臨床癥狀。敏感小鼠感染MHV-3后，單核巨噬細(xì)胞活化表達(dá)凝血酶原酶纖維介素(Fibrinogen like protein2/fibroleukin，F(xiàn)GL2)，裂解凝血酶原為有活性的凝血酶，啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起纖維蛋白沉積，血

3、管內(nèi)凝血，肝血竇血栓形成，肝細(xì)胞壞死。
　　 B、T淋巴細(xì)胞衰減子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是新近鑒定的具有抑制T細(xì)胞活化增殖的CD28免疫球蛋白超家族成員。BTLA與其配體皰疹病毒侵入受體(herpes virus entry mediator，HVEM)結(jié)合后可以抑制CMV特異的CD8+T細(xì)胞的活化增殖以及IL-2的分泌，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)節(jié)以及外周免疫耐受中發(fā)揮重要的作用。BT

4、LA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如BTLA-/-小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)，過(guò)敏性呼吸道炎癥以及自身免疫性肝炎等較WT小鼠更為敏感。BTLA在感染疾病中同樣發(fā)揮了重要作用，CMV感染中，BTLA在CMV特異的CD8+T細(xì)胞上高表達(dá)，阻斷BTLA信號(hào)，可增強(qiáng)CMV特異的CD8+T細(xì)胞的增殖，說(shuō)明BTLA可抑制病毒特異性的CTL反應(yīng)。對(duì)寄生蟲(chóng)感染的研究

5、發(fā)現(xiàn)，阻斷BTLA信號(hào)，可以加快機(jī)體對(duì)李斯特桿菌的清除。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn)，PD-1可以減輕MHV-3誘導(dǎo)的肝損傷。與WT小鼠相比，PD-1-/-小鼠MHV-3感染后肝臟病變更嚴(yán)重，死亡率更高，提示CD28家族成員參與了MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎。目前為止，BTLA在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎還未知。
　　 為明確BTLA在MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)肝炎中的作用，我們以BTLA-/-和WT小鼠為研究對(duì)象，腹腔感染MHV-3后，比較

6、兩組小鼠的生存曲線，肝臟病理，血清ALT、AST、FGL2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT小鼠在感染后9天內(nèi)全部死亡，而B(niǎo)TLA-/-小鼠在感染后20天仍有87.5％(7/8)的存活。H&E染色發(fā)現(xiàn)感染后48hWT小鼠即有嚴(yán)重的肝細(xì)胞、脾細(xì)胞壞死，到72h更劇，而同時(shí)相的BTLA-/-小鼠肝臟、脾臟細(xì)胞均較正常。與H&E結(jié)果一致，TUNEL分析可見(jiàn)WT小鼠大量肝細(xì)胞、脾細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)TLA-/-凋亡較少。BTLA-/-小鼠血清ALT、AST顯著性低于感染

7、后同時(shí)相WT小鼠。免疫雙熒光分析發(fā)現(xiàn)FGL2表達(dá)于CK18+的上皮細(xì)胞，F(xiàn)4/806的巨噬細(xì)胞，CD11C+的DC細(xì)胞和CD31+的內(nèi)皮細(xì)胞，少量表達(dá)于CD3+T細(xì)胞。BTLA-/-小鼠感染MHV-13后，血清FGL2顯著性低于WT小鼠；肝臟fgl2 mRNA水平明顯低于WT小鼠；與mRNA一致，肝臟FGL2也明顯較WT少，纖維蛋白沉積也較少。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，BTLA不是減弱，而是促進(jìn)了MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎。BTLA基因敲除后

8、可使小鼠FGL2表達(dá)顯著性降低，纖維素沉積減少，肝臟病理減輕，使MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎致死率降低。
　　 為進(jìn)一步明確BTLA促進(jìn)MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎的作用機(jī)制，首先免疫熒光分析BTLA在器官中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在肝臟、脾臟、淋巴結(jié)均有BTLA陽(yáng)性細(xì)胞。流式分析發(fā)現(xiàn)MHV-3感染后，BTLA在CD4+T、CD8+T、B細(xì)胞上表達(dá)下調(diào)，而在巨噬細(xì)胞上顯著性上調(diào)。BTLA-/-和WT小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)相當(dāng)量的共刺激分子，凋亡相關(guān)分

9、子以及促炎細(xì)胞因子。MHV-3感染后，Annex-V/PI染色發(fā)現(xiàn)，BTLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞的凋亡顯著性高于WT小鼠，進(jìn)而B(niǎo)TLA-/-小鼠MHV-3感染24h，腹腔巨噬細(xì)胞，肝臟巨噬細(xì)胞頻率明顯低于WT小鼠；巨噬細(xì)胞體外感染MHV-3，TUNEL分析其凋亡也發(fā)現(xiàn)BTLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞凋亡明顯高于WT巨噬細(xì)胞。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，巨噬細(xì)胞上BTLA的表達(dá)維持了其存活，BTLA基因敲除后，MHV-3感染可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的凋亡增加，炎癥

10、反應(yīng)減輕，F(xiàn)GL2分泌減少，進(jìn)而保護(hù)小鼠的肝臟免受損傷，提高了其生存率。
　　 為明確巨噬細(xì)胞凋亡是否會(huì)導(dǎo)致炎癥因子的減少。我們以RT-PCR方法分析BTLA-/-和WT小鼠MHV-3感染后肝臟炎癥因子的mRNA，發(fā)現(xiàn)肝臟中TNF-αmRNA顯著性低于WT小鼠，而其他細(xì)胞因子，如IL-2、IL-4等變化不明顯。流式分析巨噬細(xì)胞單個(gè)水平TNF-α分泌情況，結(jié)果顯示BTLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α分泌顯著性高于WT小鼠，但由于B

11、TLA-/-小鼠巨噬細(xì)胞凋亡顯著性高于WT小鼠，因此BTLA-/-小鼠血清TNF-α水平卻顯著性低于WT小鼠。MHV-3感染后，給BTLA-/-小鼠體內(nèi)補(bǔ)充TNF-α重組蛋白，可使肝臟病變加重，血清ALT、AST、FGL2顯著增高，死亡率增高。TNF-α-/-小鼠感染MHV-3后，其死亡率、肝臟病變以及血清ALT、AST、FGL2等顯著性低于其野生型。這些結(jié)果表明，TNF-α在BTLA促進(jìn)MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎中發(fā)揮了非常重要的作用

12、，BTLA基因敲除后，MHV-3感染所致的巨噬細(xì)胞大量凋亡，導(dǎo)致體內(nèi)TNF-α顯著性降低，F(xiàn)GL2分泌減少，肝臟病變減輕，死亡率減少。
　　 為進(jìn)一步明確巨噬細(xì)胞上BTLA分子的缺失是導(dǎo)致BTLA-/-小鼠對(duì)MHV-3耐受的主要原因，我們分選WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，過(guò)繼回輸給感染了MHV-3的BTLA-/-小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率明顯增高。WT小鼠感染MHV-3后，體內(nèi)阻斷BTLA信號(hào)，可使小鼠的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，死亡率明顯減少