香菇多糖對燒傷膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、燒傷膿毒癥至今仍是臨床急危重癥病人進(jìn)入 ICU的一個重要原因，并且具有很高的死亡率。燒傷膿毒癥對宿主免疫系統(tǒng)的影響是通過多重機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，包括輔助性T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡增加，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡減少及細(xì)胞因子譜改變等，同時巨噬細(xì)胞的功能障礙在膿毒血癥等相關(guān)炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色。香菇多糖是從香菇中提取出的一種能夠調(diào)節(jié)人體免疫及抗癌的藥物。研究表明香菇多糖也可以通過強(qiáng)化先天和獲得性免疫反應(yīng)增強(qiáng)宿主的抗

2、感染作用。巨噬細(xì)胞和 T淋巴細(xì)胞是香菇多糖免疫刺激作用的主要效應(yīng)細(xì)胞。然而，關(guān)于香菇多糖與膿毒血癥的治療效果及作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過制作小鼠燒傷膿毒癥模型，探討香菇多糖對燒傷膿毒癥小鼠的存活時間的影響、相關(guān)炎癥因子表達(dá)、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能變化，進(jìn)而研究香菇多糖對小鼠巨噬細(xì)胞增殖、凋亡、胞飲能力及相關(guān)通路的影響。從而闡明小鼠膿毒癥發(fā)生過程中香菇多糖對其免疫系統(tǒng)的影響及調(diào)控機(jī)制，從而為改善膿毒癥的預(yù)后提供更多的分子

3、依據(jù)。
　　本課題四部分的具體內(nèi)容如下：
　　第一部分香菇多糖對燒傷膿毒癥小鼠生存率及血清炎性因子影響的研究
　　目的：制備燒傷膿毒癥小鼠模型，觀察膿毒癥小鼠生物學(xué)狀況的變化、5天生存率、肝臟形態(tài)病理學(xué)變化，血清中IL-1、IL-10和IFN-γ的變化。
　　方法：將128只雄性BALB/c mice小鼠隨機(jī)分為燒傷膿毒癥組、低濃度（40 mg/kg）、中濃度（100 mg/kg）和高濃度（250 mg/kg）香

4、菇多糖干預(yù)組。在注射香菇多糖1、2、3、4天后分別處死小鼠，采集肝臟和血液樣本，分離血清。觀察膿毒癥小鼠生物學(xué)狀況的變化，HE染色法檢測肝臟病理學(xué)變化，ELLSA法檢測各組小鼠外周血血清中 IL-1、IL-10和IFN-γ的變化。另取60只小鼠處理同前，分組方法同前，用于觀察各組模型小鼠5天生存率。兩組間計(jì)量資料采用進(jìn)行student t分析，多組間比較采用ANOVA，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線法

5、，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：小鼠術(shù)后出現(xiàn)感染癥狀，24 h膿毒癥組出現(xiàn)小鼠5天生存率為6.67％，低，中，高濃度香菇多糖注射組小鼠分別在30h,42h,48h出現(xiàn)死亡，5天生存率分別為33.33%、60%和86.67%。燒傷膿毒癥小鼠5天生存率與香菇多糖劑量呈正相關(guān)(r=0.72)。膿毒癥組膿毒癥小鼠肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)；肝細(xì)胞索解離，可見大面積的肝細(xì)胞渾濁腫脹，空泡變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞；匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤，可見紅細(xì)胞積聚。再

6、加入香菇多糖后，膿毒癥小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常；有部分肝細(xì)胞變性壞死并伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤，高濃度（250 mg/kg）組小鼠肝細(xì)胞損傷最小，即香菇多糖劑量越高對膿毒癥小鼠肝細(xì)胞的損傷越少。低濃度香菇多糖組小鼠外周血中 IL-1水平與膿毒癥組相比有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中高濃度香菇多糖組小鼠外周血中 IL-1水平明顯高于膿毒癥組小鼠外周血中IL-1水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低濃度香菇多糖組小鼠外周血中IL-10水平在各個時間點(diǎn)均

7、低于膿毒癥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中高濃度香菇多糖組小鼠外周血中IL-10水平明顯低于膿毒癥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。低濃度香菇多糖組小鼠外周血中IFN-γ水平與膿毒癥組相比有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中高濃度香菇多糖組小鼠外周血中IFN-γ水平明顯高于膿毒癥組小鼠外周血中IFN-γ水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　第二部分香菇多糖對燒傷膿毒癥小鼠CD4+T細(xì)胞功能影

8、響的研究
　　目的：探討香菇多糖對CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的影響及對LPS刺激的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞ERK1/2/FoxO1信號通路表達(dá)的影響。
　　方法：應(yīng)用細(xì)胞分離試劑盒分離CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了膿毒癥組和香菇多糖干預(yù)組小鼠外周血中CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，采用ELISA檢測膿毒癥組和香菇多糖干預(yù)組小鼠外周血中CD4+

9、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的IL-10；CD4+T細(xì)胞分泌的IL-2, IFN-γ及IL-4水平，MTT法檢測CD4+T細(xì)胞的活性，實(shí)時定量 PCR檢測 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞 IL-10 mRNA的表達(dá)， Western blot檢測CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞中磷酸化 ERK1/2和磷酸化FoxO1的表達(dá)水平，熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測了香菇多糖對FoxO1轉(zhuǎn)錄活性的影響。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，兩組間計(jì)量資料采用進(jìn)行

10、 student t分析，三組以上比較使用ANOVA分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1小鼠在造模后的0到3天，CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞所占CD4+CD25+T細(xì)胞的比例明顯升高，在第3天達(dá)到峰值（74.58±8.13%），第4天稍有下降（65.31±6.29%），但是仍然明顯高于第一天，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低中高劑量香菇多糖治療后各個時間段與模型組相比， FoxP3陽性細(xì)胞所占比例均

11、顯著降低。香菇多糖組小鼠外周血CD4+CD25+T細(xì)胞分泌的的IL-10水平較同期模型組小鼠IL-10水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2香菇多糖處理組的小鼠CD4+T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的水平呈現(xiàn)上升趨勢，IL-4呈下降趨勢。MTT檢測CD4+T細(xì)胞活性顯示，香菇多糖處理組小鼠CD4+T細(xì)胞活性增強(qiáng)，且與香菇多糖的濃度相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)來自燙

12、傷合并銅綠假單胞菌感染小鼠的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠抑制CD4+T對CD3抗體產(chǎn)生的細(xì)胞增殖反應(yīng)，同時IL-4分泌增加，IFN-γ分泌減少。香菇多糖的加入降低IL-4的分泌，提高了IFN-γ的分泌。
　　4與空白CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相比，加入LPS刺激的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)量升高了3.17倍（P＜0.05），加入40，100，250ng/ml香菇多糖共刺激組的IL-10 mRN

13、A表達(dá)水平與單獨(dú)加入LPS組相比，IL-10 mRNA表達(dá)量分別下降了17.84%，48.36%，63.59%（P＜0.05）。LPS刺激的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞加入ERK抑制劑后，與單獨(dú)LPS刺激的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相比，IL-10 mRNA表達(dá)量下降了41.53%（P＜0.05），LPS刺激的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞同時加入 ERK抑制劑及香菇多糖后，與單獨(dú)加入ERK抑制劑相比，IL-10 mRNA表達(dá)量沒有變化（P＞0.05）。LPS刺激的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞加入

14、p38抑制劑后，與單獨(dú)LPS刺激的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相比， IL-10 mRNA表達(dá)量下降了38.19%（P＜0.05），LPS刺激的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞同時加入p38抑制劑及香菇多糖后，與單獨(dú)加入p38抑制劑相比，IL-10 mRNA表達(dá)量下降了43.27%（P＜0.05）。LPS加入調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的不同時間點(diǎn)，p-ERK1/2及p-FoxO1表達(dá)顯著增高，在15分鐘達(dá)到最高峰。加入香菇多糖后的各時間點(diǎn)，pERK1/2和 pFoxO1的表達(dá)顯著下降（

15、P＜0.05）。LPS刺激的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞加入不同劑量（40，100，250ng/ml）香菇多糖后，IL-10啟動子熒光素酶活性與單純LPS刺激的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相比，分別下降了18.31%，47.51%及62.43%。
　　第三部分香菇多糖對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7活性影響的研究
　　目的：探討香菇多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7活性、凋亡、胞飲能力、分泌的NO和TNF-α、及MHC分子表型改變的影響。
　　方法

16、：將RAW264.7細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)后，分為三組：PBS組、100 ng/ml LPS組、100 ng/ml香菇多糖和100 ng/ml LPS共培養(yǎng)組。以上三組細(xì)胞:MTT檢測LPS刺激后24h,48h,72h的細(xì)胞活性；流式細(xì)胞法檢測48h后細(xì)胞凋亡比率，MHC I及MHC II分子陽性細(xì)胞的比率；Western Blot檢測48h后凋亡相關(guān)蛋白caspase3, Bax, Bcl-2的表達(dá)；格里斯反應(yīng)和ELISA方法測定RAW

17、264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌的NO和 TNF-α水平；中性紅染料攝取評價24h后RAW264.7細(xì)胞的吞飲活動。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第二部分。
　　結(jié)果：
　　1加入香菇多糖（100 ng/ml）后細(xì)胞的活性與LPS相比顯著增高，48h細(xì)胞的活力達(dá)到最高峰，為對照組的81.23%（P＜0.05），此后72h稍有下降，為對照組的74.59%（P＜0.05）；
　　2 LPS處理組細(xì)胞凋亡率為31.0%，加入香菇多糖后，細(xì)胞凋亡率下

18、降至24.8%，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　3與PBS對照相比，用LPS處理細(xì)胞后，促凋亡蛋白（Caspase3和Bax）的表達(dá)分別升高了4.62和2.87倍，而抗凋亡蛋白（Bcl-2）表達(dá)降低了63.28%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在香菇多糖(100 ng/ml)處理后細(xì)胞的促凋亡蛋白（Caspase3和 Bax）與 LPS相比分別降低了38.39%和52.17%，而抗凋亡蛋白（Bcl-2）表

19、達(dá)升高了1.47倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　4 PBS對照組NO及TNF-α產(chǎn)生量分別為4.67μg/ml及18.25μg, LPS刺激組為22.59μg/ml及89.59μg/ml，香菇多糖顯著的降低了NO及TNF-α的水平，為12.21μg/ml，52.49μg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　550ng/ml香菇多糖對 RAW264.7細(xì)胞的胞飲能力沒有顯著影響，100ng/ml香菇多

20、糖能夠顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的吞飲活動，而且呈劑量依賴性；
　　6正常RAW264.7細(xì)胞MHC I，MHC II陽性表達(dá)率分別為43.36%及7.28%。香菇多糖處理組增強(qiáng)了MHC II分子表達(dá)，陽性表達(dá)率為27.64%，與正常RAW264.7組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；香菇多糖處理組MHC I分子陽性表達(dá)率為40.65%，與正常RAW264.7組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　第四部分香菇多糖

21、對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7影響機(jī)制的研究
　　目的：探討香菇多糖對 LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制是否是通過抑制ERK/NF-κB信號通路實(shí)現(xiàn)的。
　　方法：應(yīng)用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測香菇多糖對iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)；采用熒光素酶報(bào)告基因檢測香菇多糖對 PBS刺激巨噬細(xì)胞組，LPS單獨(dú)刺激巨噬細(xì)胞組，以及香菇多糖與 LPS共刺激巨噬細(xì)胞組共計(jì)三組細(xì)胞NF-κB啟動子活性的影響；We

22、stern blot檢測pERK1/2、pJNK1/2和NF-κB p65的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第二部分。
　　結(jié)果：
　　1不同濃度香菇多糖，在沒有LPS刺激的情況下，iNOS mRNA和蛋白無表達(dá)，100ng/ml LPS能顯著的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)。與單純的LPS相比，加入20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml香菇多糖，iNOS mRNA的表達(dá)分別下降了31%，49%和78

23、%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），iNOS蛋白的表達(dá)分別下降了16%，33%和84%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2與PBS對照組相比， LPS單獨(dú)刺激的巨噬細(xì)胞RAW264.7中熒光素酶活性升高了51.27%，而LPS和香菇多糖共刺激條件下熒光素酶活性與LPS相比，下降了27.28%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），仍顯著高于PBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3 pERK1/2的表達(dá)在LP

24、S刺激后的0-6h內(nèi)的四個時間點(diǎn)逐漸升高。pJNK1/2及核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)在LPS刺激后的0.5小時達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。香菇多糖能顯著降低各時間點(diǎn)pERK1/2及pJNK1/2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在LPS刺激后的0.5小時，香菇多糖并不能降低核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)，但是在3小時能顯著降低核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1香菇多糖通過增強(qiáng)促

25、炎因子 IL-1、IFN-γ的表達(dá)，降低抗炎因子IL-10的表達(dá)，部分恢復(fù)燒傷膿毒癥小鼠免疫系統(tǒng)的麻痹或癱瘓狀態(tài)，減少小鼠肝臟損傷，從而增加小鼠的生存率。
　　2香菇多糖可以抑制 CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的 ERK-FoxO1通路，減少IL-10的表達(dá)，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖，抑制IL-4表達(dá)并促進(jìn)IL-2和IFN-γ的表達(dá)。
　　3香菇多糖可以降低巨噬細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞活力、減少 NO和TNF-α炎

26、性物質(zhì)分泌，促進(jìn)巨噬細(xì)胞胞飲能力以及巨噬細(xì)胞MHC II分子的表達(dá)。
　　4香菇多糖可以抑制iNOS的表達(dá)，抑制ERK1/2和JNK1/2的磷酸化，同時抑制NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄活性和核內(nèi)表達(dá)。
　　綜上所述，我們的研究表明香菇多糖可以抑制CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的ERK-FoxO1通路，來促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞極化；同時香菇多糖可抑制巨噬細(xì)胞ERK1/2，JNK1/2，NF-κB通路，促進(jìn)巨噬細(xì)