開口箭多糖免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多糖是生物體內(nèi)普遍存在的一類高分子化合物,具有許多重要的生理功能。多糖的藥用研究始于1943年,60多年來,人們從動物、植物、微生物中提取分離了大量活性多糖,發(fā)現(xiàn)多糖具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老、抗骨髓抑制和抗輻射等一系列作用,在臨床上已用于治療肝炎、艾滋病、癌癥和許多其它疾病。免疫活性多糖因其來源廣泛、效果確切、毒副作用小等受到了普遍重視。
　　 開口箭(Tupistra chinensis Baker)

2、又名牛尾七、竹根七等,主要分布于我國西南地區(qū),民間主要用于治療咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、胃痛、毒蛇狂犬咬傷、蚊蟲叮咬等。開口箭屬植物主要活性成分為皂苷,從該屬植物根莖中己分離提純出多種皂苷成份。研究發(fā)現(xiàn),開口箭具有良好的抗炎作用,有良好的開發(fā)利用價值。皂苷是其抗炎的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一,抑制炎癥介質(zhì)PGE2、NO的產(chǎn)生是其作用機(jī)理；開口箭皂苷體外對HL-60、Caski、U251腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用,體內(nèi)外對S180肉瘤細(xì)胞也有很

3、強(qiáng)的抑制作用；同時開口箭皂苷還能夠抑制血小板的聚集與活化。也有研究報道,開口箭水提物能明顯抑制炎癥早期的水腫和滲出,具有抗炎鎮(zhèn)痛的功效。我們在活性篩選時發(fā)現(xiàn),開口箭水提物具有一定的免疫活性,從而引起了我們的研究興趣。本文對分離得到的開口箭多糖組分TCBPⅡ(Tupistra chinensis.Baker polysaccharides Ⅱ,TCBP Ⅱ)的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　 目的:
　　 1.提

4、取分離開口箭粗多糖并篩選出活性成分。
　　 2.研究開口箭多糖(TCBPⅡ)體外對正常小鼠脾細(xì)胞代謝MTT活力及產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)的影響；體外對正常小鼠腹腔滲出細(xì)胞代謝MTT活力及產(chǎn)生TNF-α的影響；體內(nèi)對正常小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)、血清溶血素水平的影響。
　　 3.研究開口箭多糖(TCBPⅡ)體內(nèi)對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠的DTH、單核巨噬細(xì)

5、胞吞噬功能、血清溶血素水平的影響。
　　 4.研究開口箭多糖(TCBPⅡ)對荷S180實(shí)體瘤小鼠抑瘤作用、血清TNF-α、IFN-γ含量及腹腔單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。
　　 方法:
　　 1.采用熱水提取、乙醇沉淀法從開口箭植物的根莖中提取粗制多糖,再用Sevage法去蛋白。經(jīng)DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換柱對粗制多糖進(jìn)行分離純化,得到不同組分開口箭多糖。通過測定不同組分多糖對正常

6、小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖作用篩選出活性成分,命名TCBPⅡ。
　　 2.取正常小鼠脾細(xì)胞,加入開口箭多糖(TCBPⅡ),在37℃下培養(yǎng)48h,收集培養(yǎng)上清,用ELISA方法檢測其中TNF-α、IFN-γ、IL-2的含量,或者用MTT比色法檢測細(xì)胞代謝MTT活力。
　　 3.取正常小鼠腹腔滲出細(xì)胞,加入開口箭多糖(TCBPⅡ),在37℃下培養(yǎng)10h,收集培養(yǎng)上清,用EIASA方法檢測其中TNF-α的含量,或者用MTT比色法檢測

7、細(xì)胞代謝MTT活力。
　　 4.正常小鼠50只,隨機(jī)分為5組,生理鹽水對照組、陽性藥物(靈芝多糖100mg/kg)組、TCBPⅡ低、中、高劑量(50,100,200mg/kg)組,給藥組小鼠分別連續(xù)腹腔注射(ip)干預(yù)藥物7d。于給藥后第1日用1％二硝基氟苯(dinitro-fluorobenzene,DNFB)腹部致敏,末次給藥后將1％DNFB涂抹于5組實(shí)驗(yàn)小鼠右側(cè)耳廓,24h后處死動物,用打孔器取相同面積兩側(cè)耳片稱重,比較給

8、藥組與對照組耳廓腫脹程度。
　　 5.正常小鼠50只,隨機(jī)分為5組,生理鹽水對照組、陽性藥物(靈芝多糖100mg/kg)組、TCBPⅡ低、中、高劑量(50,100,200mg/kg)組,給藥組小鼠分別連續(xù)ip干預(yù)藥物7d。給藥后第2天上午,各鼠腹腔注射20％(V/V)的生理鹽水兔紅細(xì)胞0.2 ml進(jìn)行免疫,同日下午繼續(xù)給藥,免疫后d6(免疫當(dāng)天為d0),動物摘眼球取血,分離和收集血清用于血清溶血素水平測定。
　　 6.皮

9、下注射環(huán)磷酰胺(CTX)復(fù)制免疫功能低下的動物模型。小鼠50只,隨機(jī)分為5組,正常對照組、CTX模型組、TCBP Ⅱ低、中、高劑量(50,100,200mg/kg)+CTX組,采用DNFB誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed-typehypersensitivity,DTH)模型,觀察小鼠細(xì)胞免疫功能；碳廓清法檢測單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能；兔紅細(xì)胞免疫法檢測體液免疫功能。
　　 7.建立荷S180實(shí)體瘤小鼠動物模型,生理鹽水對照組:

10、每天腹腔注射(ip)無菌生理鹽水0.1ml/10g體重,其他組給藥體積與此相同；陽性對照組:每天ip靈芝多糖100 mg/kg；TCBP Ⅱ低、中、高劑量組:每天分別ip TCBP Ⅱ 50、100、200mg/kg；連續(xù)給藥7d后次日上午,分離血清用于TNF-α和IFN-γ的含量測定。取血后,分離瘤體,稱重,并計算抑瘤率。
　　 8.取荷S180實(shí)體瘤小鼠50只,隨機(jī)分為生理鹽水對照組、陽性藥物(靈芝多糖100 mg/kg)組

11、、TCBPⅡ低、中、高劑量(50,100,200mg/kg)組,每組10只,腹腔注射給藥,每天1次,連續(xù)7天。停藥24h后,每只小鼠腹腔注射10％雞紅細(xì)胞懸液1ml,30min后,脫頸椎處死動物,檢測腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活力。
　　 9.統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,兩樣本均數(shù)比較,用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Sample T Test)。多個樣本均數(shù)比較,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析(One-Way

12、 ANOVA),方差齊時,采用LSD方法進(jìn)行組間兩兩比較；方差不齊時,作 Welch檢驗(yàn),再用DunnettT3方法進(jìn)行組間兩兩比較,顯著性水準(zhǔn)取α=0.05,以P<0.05時,組間差異判斷為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.開口箭多糖(TCBPⅡ)是篩選的含量較多且活性最強(qiáng)部位。
　　 2.TCBPⅡ體外可以顯著增強(qiáng)正常小鼠免疫細(xì)胞代謝活力,促進(jìn)正常小鼠免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α,但對IFN-γ、I

13、L-2的分泌無促進(jìn)作用。TCBPⅡ整體水平上無促進(jìn)正常小鼠DTH和血清溶血素抗體生成作用。
　　 3.采用環(huán)磷酰胺成功建立免疫功能低下的小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 4.TCBPⅡ能顯著增強(qiáng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的DTH,增加校正碳粒廓清指數(shù)(α),提高吞噬活性,促進(jìn)血清溶血素抗體生成,提示TCBPⅡ能夠顯著促進(jìn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能抑制小鼠的非特異性和特異性(體液免疫和細(xì)胞免疫)免疫功能。
　　 5.成功建立了荷S