FOXE-1甲基化與表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析及其與結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:FOXE1(Folkhead box E1)基因是叉頭結(jié)構(gòu)域蛋白家族的重要一員，在甲狀腺胚胎發(fā)育中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXE1基因純合突變可以引起甲狀腺發(fā)育不全，導(dǎo)致先天性甲狀腺功能低下和腭裂等各種畸形。近年的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXE1基因和惡性腫瘤的發(fā)生也具有密切聯(lián)系，甲狀腺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌（皮膚、肺、食管等）與FOXE1基因多態(tài)性或突變緊密相關(guān)，F(xiàn)OXE1基因是這些惡性腫瘤的易感基因。在胰腺癌和乳腺癌中，均有FOXE1基因啟動

2、子高甲基化的報道。但在結(jié)直腸癌中，尚未見FOXE1基因的相關(guān)研究。本研究的目的在于通過檢測結(jié)直腸癌組織與配對正常腸粘膜中FOXE1啟動子區(qū)域CpG島的甲基化情況，結(jié)合其在mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平的檢測，初步揭示FOXE1基因啟動子區(qū)域CpG島的甲基化調(diào)控其表達(dá)及與結(jié)直腸癌的發(fā)生具有密切相關(guān)性。
　　材料與方法:
　　細(xì)胞株:腸癌細(xì)株:HCT116，RKO，LS147（上海中科院細(xì)胞室）
　　組織標(biāo)本:83例的結(jié)直

3、腸癌組織標(biāo)本均來自2008年12月-2010年3月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科手術(shù)后標(biāo)本，均具有配對的距離癌灶至少5cm的癌旁正常粘膜組織。所有標(biāo)本均為術(shù)前未行新輔助放化療的初治患者，所有手術(shù)均為根治性手術(shù)切除，并且術(shù)后均具有明確的病理診斷。所有腫瘤標(biāo)本及其對應(yīng)的正常粘膜組織（距離腫瘤病灶5cm以上）取材時間不超過術(shù)后半小時且均保存在-196度液氮中，其中提取RNA的組織均為RNALater保存。所有病人均簽署過知情同意書。病理分期嚴(yán)格

4、按照AJCC(美國癌癥聯(lián)合委員會)分期第七版。
　　芯片初篩:大腸外科蔡國響博士前期應(yīng)用全基因組甲基化芯片(IlluminaHumanMethylation27)篩選結(jié)直腸癌相關(guān)甲基化基因，發(fā)現(xiàn)FOXE1等差異甲基化基因，從而為本研究提供候選的目標(biāo)基因。
　　實驗方法:
　　1.采用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測細(xì)胞株中基因FOXE1啟動子甲基化狀態(tài)，對其中MSP陽性細(xì)胞株采用去甲基化試劑5-aza-2-CdR干

5、預(yù)。干預(yù)前后分別采用定量甲基化(qMSP)和TaqMan定量PCR(qRT-PCR)檢測FOXE1甲基化水平和表達(dá)水平。
　　2.在83例結(jié)直腸癌組織及其配對癌旁正常粘膜組織中提取DNA并亞硫酸氫鹽修飾，采用定量甲基化(qMSP)方法檢測基因FOXE1啟動子甲基化水平，對有RNAlater保存的40例癌組織及其配對癌旁正常粘膜組織抽提RNA，采用TaqMan定量PCR(qRT-PCR)方法檢測FOXE1表達(dá)水平。
　　數(shù)據(jù)分

6、析:
　　根據(jù)樣本、標(biāo)準(zhǔn)品中目標(biāo)基因以及內(nèi)參基因?qū)崟r定量甲基化PCR擴(kuò)增的Ct值計算甲基化比例(percentage of methylated reference，PMR)，PMR=100×（目標(biāo)基因/內(nèi)參）樣本/（目標(biāo)基因/內(nèi)參基因）標(biāo)準(zhǔn)品，PMR＜4定義為陰性結(jié)果（非甲基化），PMR≥4定義為陽性結(jié)果（甲基化）。將每個樣本目標(biāo)基因CT值與內(nèi)參CT值求delta CT值，將2-ΔCt作為目標(biāo)基因相對表達(dá)量。采用配對卡方檢驗分析

7、83對癌與癌旁FOXE1基因啟動子區(qū)域甲基化水平差異，Pearson X2檢驗分析83例癌組織中FOXE1基因甲基化與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性，采用配對t檢驗分析40對癌與配對正常組織之間FOXE1表達(dá)差異，獨立樣本t檢驗分析40例癌組織中FOXE1啟動子區(qū)域甲基化水平與表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)性。采用Kaplan-Meier檢驗分析甲基化與預(yù)后關(guān)系，所有檢驗均為雙側(cè)，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義.，所有檢驗均采用SPSS19.0軟件包.
　　結(jié)

8、果:三株細(xì)胞株中FOXE1甲基化水平檢測中，RKO為MSP陽性，LS147和HCT116為MSP陰性，去甲基化能上調(diào)FOXE1表達(dá)。83例癌與配對的正常組織中，F(xiàn)OXE1在83例癌組織中有63例為甲基化陽性，而在配對的正常組織中則均為甲基化陰性。Fisher精確概率法檢驗顯示二者甲基化有明顯差異(P＜0.001)，在癌組織中中甲基化陽性率顯著高于配對正常組織;40對癌與配對的正常組織中，F(xiàn)OXE1在癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(P=

9、0.046);在40例癌組織同時行甲基化和表達(dá)的定量檢測，獨立樣本t檢驗顯示癌組織甲基化和表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(p=0.048)。FOXE1甲基化水平與平均年齡，性別，腫瘤部位，病理類型，分化程度，脈管侵犯情況以及TNM分期等臨床病理特征均無明顯關(guān)聯(lián)性。生存分析顯示，甲基化和非甲基化組患者在DFS(p=0.618)及OS(P=0.500)均沒有顯著性差異。
　　結(jié)論:FOXE1基因啟動子高甲基化可能是FOXE1基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制之一，