高血糖激素(CHH)在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)生理代謝中作用機(jī)制的研究.pdf

1、高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone,CHH)是一類非常重要的神經(jīng)肽激素,在甲殼類體內(nèi)行使多種重要功能。本文首先克隆得到凡納濱對(duì)蝦高血糖激素基因的全長(zhǎng)cDNA序列,重組表達(dá)其開放閱讀框(ORF),然后將純化的重組高血糖激素注射到凡納濱對(duì)蝦體內(nèi),以此來研究高血糖激素對(duì)對(duì)蝦生理代謝調(diào)控的影響,主要包括方面的內(nèi)容:
　?、欧布{濱對(duì)蝦高血糖激素基因的全長(zhǎng)克隆和原核表達(dá);
　?、谱⑸渲亟M高血糖激

2、素對(duì)凡納濱對(duì)蝦鰓絲離子轉(zhuǎn)運(yùn)、血細(xì)胞防御、糖類代謝作用的研究
　?、狈布{濱對(duì)蝦高血糖激素基因基因克隆和表達(dá)分析
　　通過RACE技術(shù)獲得凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)眼柄高血糖激素(LvCHH)全長(zhǎng) cDNA序列,全長(zhǎng)846bp,GenBank登錄號(hào):HM748790.2。序列分析表明 LvCHH基因含有65bp的5’端非編碼區(qū)、436bp的3’端非編碼區(qū)和345bp的開放閱讀框,而且3’端非編碼區(qū)含有

3、保守加尾信號(hào)(AATAA)和poly(A)尾巴,開放閱讀框編碼114個(gè)氨基酸,信號(hào)肽長(zhǎng)度為24個(gè)氨基酸,具有高血糖激素家族特有的標(biāo)志肽段。同源性分析顯示,LvCHH與相近物種的同源性較高,其中與刀額新對(duì)蝦(Metapenaeus ensis)的同源性為76％,與斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)的同源性的為65%,與云斑厚紋蟹(Pachygrapsusu marmoratus)的同源性為53%,這些序列中都含有保守的6個(gè)半胱氨酸

4、殘基;由系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知,LvCHH與日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)、斑節(jié)對(duì)蝦、刀額新對(duì)蝦聚為一枝,通過與同物種的不同CHH序列進(jìn)行比較,推測(cè)LvCHH為CHH-A型中的一種基因;LvCHH基因在凡納濱對(duì)蝦腹神經(jīng)、眼柄、心臟、肝胰臟和肌肉中均有表達(dá),其中心臟和眼柄中的表達(dá)量較高,肌肉中的表達(dá)量較低,而鰓絲中沒有表達(dá)。通過構(gòu)建 LvCHH基因原核表達(dá)載體 p32a-LvCHH,在大腸桿菌(Escherichi

5、a coli)BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)含6個(gè)His標(biāo)簽的重組LvCHH融合蛋白,由帶有 His標(biāo)簽的 Ni2+親合層析柱純化得到重組高血糖激素蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析顯示在20KD處有顯著誘導(dǎo)條帶,與預(yù)測(cè)的分子量大小基本一致,Western blot分析表明可以與anti-His抗體特異性結(jié)合,從而證明高血糖激素重組蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。在注射純化重組高血糖激素后48h內(nèi),測(cè)定鰓絲Na+/K+-ATPase活力和血糖含量,結(jié)

6、果表明,各處理組Na+/K+-ATPase活力在0-6h內(nèi)呈峰值變化,均在1h時(shí)達(dá)到最大值,20和30μg純化蛋白/shrimp-1處理組在1h時(shí)顯著高于對(duì)照組水平(P<0.05)。
　　2.注射高血糖激素對(duì)凡納濱對(duì)蝦鰓絲信號(hào)通路和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　本部分研究了在注射重組高血糖激素對(duì)凡納濱對(duì)蝦鰓絲信號(hào)通路和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)驗(yàn)共分為3個(gè)處理組(對(duì)照組、10μg純化重組CHH蛋白/shrimp處理組、20μg純化重組CHH蛋

7、白/shrimp處理組),各處理組均設(shè)置3個(gè)平行,取樣時(shí)間:0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h。結(jié)果表明:注射高血糖激素后,各處理組鰓絲生物胺含量均有顯著變化,但是變化最明顯的是NE, DA只在6 h,5-HT在3、6 h時(shí)顯著高于對(duì)照組水平,說明響應(yīng)高血糖信號(hào)最主要的生物胺是 NE,且不同處理組之間生物胺含量沒有顯著變化;各處理組cAMP含量只在1h時(shí)顯著高于對(duì)照組水平,而cGMP含量在1-48 h內(nèi)均顯著高于對(duì)

8、照組水平,說明起主要作用的是 cGMP,且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系;而響應(yīng) cGMP的蛋白激酶主要是 PKA;而三種離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶首先響應(yīng)的是Na+/K+-ATPase和HCO3—ATPase,V-ATPase活力在12 h后才開始顯著高于對(duì)照組水平。血淋巴滲透壓也是在12 h后開始顯著升高。通過以上的分析,可以得出在注射高血糖激素后,信號(hào)傳導(dǎo)的途徑為:NE cGMP PKA和PKC三種離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶血淋巴滲透壓。
　　3.注射高血糖激素對(duì)

9、凡納濱對(duì)蝦糖類代謝影響
　　本部分研究了在注射重組高血糖激素對(duì)凡納濱對(duì)蝦糖類代謝的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同上,結(jié)果表明,在注射高血糖激素后,肝胰臟cAMP和 cGMP的含量表現(xiàn)基本一致,都是在3-48 h內(nèi)顯著高于對(duì)照組水平,說明肝胰臟cAMP和cGMP響應(yīng)高血糖激素的刺激在同一水平;肌肉中的糖原合酶活性沒有變化而糖原磷酸化酶的活性在3-48 h內(nèi)顯著高于對(duì)照組水平,而肝胰臟中的GS和GP活力都有顯著升高的變化,而肝胰臟和肌肉中的FBPa

10、se和PEPCK的活力都有顯著變化,從以上結(jié)果可以看出,肌肉是響應(yīng)高血糖激素的主要組織,在糖原合酶活力不變的前提下,糖原磷酸酶的活力增加,這樣,葡糖產(chǎn)生的速度會(huì)大于葡糖消耗的速度,造成血淋巴中葡糖含量的升高。而糖異生在兩個(gè)組織中都有作用,但主要是在肝胰臟的發(fā)揮作用,通過糖原分解和糖異生的共同作用,最終導(dǎo)致血糖含量的上升。
　　4.注射高血糖激素對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫防御指標(biāo)的影響
　　本部分研究了在注射重組高血糖激素對(duì)凡納濱對(duì)蝦免

11、疫防御指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同上,結(jié)果表明,血淋巴中DA的含量在6 h的時(shí)候顯著高于對(duì)照組水平,而其他時(shí)間的含量與對(duì)照組相比沒有顯著變化,血淋巴5-HT的含量在0.5-12 h內(nèi)均顯著高于對(duì)照組水平,NE含量在3-12 h內(nèi)顯著高于對(duì)照組水平,由結(jié)果可以看出在高血糖激素的刺激下,血淋巴中首先做出響應(yīng)的是5-HT,其次是NE,最后是DA。生物胺的變化導(dǎo)致血細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生改變,血細(xì)胞數(shù)量在0.5-12內(nèi)都顯著高于對(duì)照組水平,這與5-HT的含量

12、變化一致。酚氧化酶原的活力在3-48 h內(nèi)顯著高于對(duì)照組水平,酚氧化酶活力在1-6h內(nèi)顯著高于對(duì)照組水平,由結(jié)果可以看出,血細(xì)胞數(shù)量的變化伴隨著酚氧化酶及酚氧化酶原活力的改變,但是酚氧化酶原的變化滯后于酚氧化酶,這可能是因?yàn)樾盘?hào)刺激處于血淋巴中的酚氧化酶由低活性的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘臓顟B(tài),而伴隨著酚氧化酶活性的升高,激活了酚氧化酶原的活力,進(jìn)一步提供更多的酚氧化酶來應(yīng)對(duì)外界的刺激。凡納濱對(duì)蝦的抗菌活力在0.5-6 h內(nèi)顯著高于對(duì)照組水平,