非食桑昆蟲蓖麻蠶和柞蠶β-FFase的體內(nèi)外表達(dá)和活性分析.pdf

1、蓖麻蠶(Samia cynthia ricini)和柞蠶(Antheraea pernyi)是與家蠶(Bombyx mori)親緣較近但食性不同的鱗翅目昆蟲。桑葉的乳汁中含有大量的DNJ、D-AB1等糖類似生物堿，是α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)的強(qiáng)力抑制劑，對(duì)蓖麻蠶等非食桑昆蟲有很強(qiáng)的毒性，但家蠶卻以桑樹為唯一寄主植物。家蠶BmSuc1是首個(gè)被分子克隆和功能鑒定的動(dòng)物型β-呋喃果糖苷酶(EC3.2.1.26，β－FFase)編

2、碼基因，可能與家蠶抵抗桑葉生物堿毒性的適應(yīng)機(jī)制有關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻蠶和柞蠶的體內(nèi)也存在β－FFase同源基因，其中蓖麻蠶有2個(gè)(ScSuc1和ScSuc2)，柞蠶有3個(gè)(ApSuc1a、ApSuc1b和ApSuc2)。這些基因在蓖麻蠶和柞蠶的5齡3天幼蟲體內(nèi)幾乎不被轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步暗示了β－FFase的表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能涉及食桑/非食桑昆蟲的食性選擇與進(jìn)化。
　　本研究首先調(diào)查了蓖麻蠶、柞蠶和家蠶體內(nèi)蔗糖水解酶的特性。發(fā)現(xiàn)非食

3、桑昆蟲蓖麻蠶和柞蠶的中腸蔗糖水解酶主要為α-葡萄糖苷酶，而食桑昆蟲家蠶中腸的蔗糖水解酶主要為不受DNJ抑制的β－FFase。以加有DNJ的蔗糖和棉籽糖作為底物，對(duì)中腸總蛋白β－FFase活性的分析結(jié)果進(jìn)一步表明，蓖麻蠶和柞蠶的中腸粗提物幾乎沒有水解果糖基的能力，即沒有表現(xiàn)出β－FFase的酶學(xué)特征，而家蠶的中腸粗提物具有顯著的水解果糖基的β－FFase活性。
　　同時(shí)，根據(jù)前期研究所獲得的蓖麻蠶和柞蠶β－FFase同源基因的上下游

4、及中間片段的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，利用重疊延伸 PCR的方法對(duì)各片段進(jìn)行拼接，成功獲得了上述5個(gè)基因的全長(zhǎng) ORF。將拼接得到的各基因 ORF和 BmSuc1分別構(gòu)建pET-24b重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至E. coliBL21(DE3)中，對(duì)重組子進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化了可溶性蛋白的誘導(dǎo)條件。Western blot結(jié)果表明ScSUC1、ApSUC1a和BmSUC1的重組蛋白表達(dá)獲得成功，其他三個(gè)重組蛋白均未得到表達(dá)。對(duì)表達(dá)成功的重組蛋白

5、進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni-NTA親和層析柱分離純化目的蛋白，采用3,5-二硝基水楊酸法比較了ScSUC1、ApSUC1a和BmSUC1的酶活特征。pH對(duì)酶活性的影響曲線表明，相對(duì)于BmSUC1，ScSUC1和ApSUC1a幾乎沒有活性，說(shuō)明ScSUC1和ApSUC1a可能本身并不具備β－FFase的酶活特性，或其功能活性更需要借助于翻譯后的加工和修飾作用。
　　本研究從體內(nèi)和體外兩方面對(duì)蓖麻蠶和柞蠶的β－FFase活性特征進(jìn)行了檢