柞蠶脂肪酶相關(guān)蛋白(ApLSP)的表達(dá)模式和活性分析.pdf

1、脂肪酶是自然界中無處不在的酶,在脂肪代謝中催化三酰甘油水解成游離脂肪酸和甘油的過程中有重要作用。但目前關(guān)于昆蟲脂肪酶的報道是很少的。脂肪酶一種絲氨酸水解酶，有由絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸和組氨酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域。我們主要研究了柞蠶脂肪酶相關(guān)蛋白（Lipase-related protein，ApLSP）在柞蠶體內(nèi)的的表達(dá)模式和體外的酶活活性特點(diǎn)。
　　本文通過設(shè)計特異性引物，經(jīng)過PCR技術(shù)克隆出1032bp的開放閱讀框并成功構(gòu)建了原

2、核表達(dá)載體 pET-28a-ApLSP，后經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 BL21（DE3）后用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS-PAGE和Western Blot檢測成熟的目的蛋白分子量大小為40.2 kDa，和預(yù)測的分子量一致，表明ApLSP蛋白成功表達(dá)。在變性條件下利用Ni-NTA親和層析純化對重組蛋白進(jìn)行純化，獲得了高純度的目的蛋白，以此蛋白免疫新西蘭大白兔獲得抗ApLSP多克隆抗體，并用于后續(xù)的功能分析。
　　利用實(shí)時定量P

3、CR和Western Blot的方法對5齡第3天柞蠶幼蟲的各組織(表皮、絲腺、脂肪體、中腸、馬氏管和血細(xì)胞)中ApLSP基因和蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。實(shí)時定量PCR結(jié)果表明ApLSP基因在所有檢測的組織中都有表達(dá)，且在中腸高表達(dá)。Western Blot結(jié)果表明ApLSP蛋白在所檢測的組織中分布不同于ApLSP基因在組織中的分布，ApLSP蛋白于只在馬氏管中被檢測到。
　　選取5齡第3天的柞蠶幼蟲分別注射熱滅活大腸桿菌(Esche

4、richia coli)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus)四種病原微生物進(jìn)行免疫刺激，利用實(shí)時定量PCR檢測中腸中ApLSP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和Western Blot檢測馬氏管中ApLSP的蛋白表達(dá)情況。與注射 PBS對照相比較，結(jié)果表明四種病原微生物的免疫刺激都能顯著的上調(diào)或下調(diào)ApLSP mRNA和

5、蛋白水平的表達(dá)，但是上調(diào)或下調(diào)的時間和程度都不同。
　　利用表達(dá)純化的ApLSP蛋白檢測其體外酶活活性及金屬離子、抑制劑和表面活性對其活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ApLSP蛋白的最適溫度和最適 pH為35℃和8。Mg2+, Na+, Ca2+和 b-mercaptoethanol可以增強(qiáng)ApLSP酶活性，和對照相比，酶活性受到 Zn2+, Cu2+和 Fe3+的抑制。表面活性劑（SDS, glycerol和Tween-20）將酶活性