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文檔簡介
1、生長激素釋放激素(GrowthHormoneReleasingHormone,GHRH)是由下丘腦合成并分泌、存在于人和動物體內的一種生物活性物質,能夠促進垂體生長激素(GrowthHormone,GH)的合成與分泌。腦外異位分泌的GHRH蛋白,不論是其成熟形式還是截短的多肽形式,都具有生物活性,并且血清中較低水平的GHRH就能很好的促進GH的分泌。肌肉組織常常作為基因治療或基因免疫的靶器官,利用肌肉異位表達GHRH,可以提高動物的生長
2、速度和生產效益。 本研究借鑒基因治療和基因疫苗的原理構建了兩種表達豬GHRH的表達質?!猵HC和pCM。表達質粒pHC含有由CMV極早期啟動子和豬的骨骼肌alpha-肌動蛋白(α-actm)啟動子構成的雜合啟動子和雜合內含子(intron),表達質粒pCM含有CMV啟動子用來作為對照。在體外,將6種真核表達質粒pGD、pGC、pGE、pGB、pHC和pCM轉染小鼠成肌細胞C2C12進行瞬時表達,另外用不含GHRHcDNA序列的
3、空質粒p5f3f作為陰性對照。轉染后C2C12細胞經2%馬血清誘導分化為肌管細胞,分別在轉染后24h、48h、72h和96h提取細胞總RNA和收集細胞培養(yǎng)上清,采用RT-PCR和Northernblot檢測GHRH在mRNA水平上的表達,RIA和Westernblot檢測GHRH在蛋白水平上的表達,結果表明GHRH基因得到了成功表達并分泌到細胞外,并且,pCM載體的表達活性高于其他幾種載體的表達活性。體內大鼠實驗共分為7組(25只/組)
4、,包括6個質粒處理組(0.2mg質粒溶于0.2mlPBS中)和一個對照組(0.2mlPBS),通過直接肌肉注射異位表達GHRH。結果表明,6種GHRH表達質粒pHC、pGD、pGC、pGE、pCM和pGB對大鼠的生長是有促進作用的,增重提高率分別為6.42%、5.83%、5.32%、2.87%、1.11%和0.35%。從5天的階段性增重結果來看,在5-10天,pHC質粒處理組大鼠的增重效果顯著,為40.73±0.88g而對照組為35.5
5、6±1.23g,p<0.05:在10-15天,pHC質粒處理組增重效果顯著,為37.49±2.85g而對照組為33.00±1.56g,p<0.05;在15-20天,pGC組和pGB組效果顯著,分別為28.66±1.39g和26.78±1.40g,而對照組為21.77±1.27g,p<0.05。同時,質粒處理組大鼠血清IGF-I水平高于對照組。組織切片檢查和血清生化指標檢測結果表明,通過肌肉注射GHRH表達質粒沒有對大鼠造成不良影響。
6、 另外,將肌細胞特異表達基因的幾種調控元件序列:肌細胞-特異增強子結合核因子(MEF-1)、MEF-2、轉錄增強因子-1(TEF-1)和血清反應元件位點(SRE),經過組合成合成啟動子元件,構建成表達載體pSP,以用來作為一種對照。通過在體外轉染C2C12細胞,進行了瞬時表達,經Northernblot和RIA檢測,結果表明,pSP質粒在C2C12細胞中表達較高水平的GHRH,接近于CMV啟動子質粒pCM的表達水平。 通過本
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