基于BIPES分析抗生素短期作用對(duì)小鼠腸道菌群的影響.pdf

1、微生物在自然界以群落形式廣泛存在。人體從內(nèi)到外充滿著數(shù)以億計(jì)的微生物，其中絕大多數(shù)棲息在人體的腸道內(nèi)，它們參與了人體的營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育、新陳代謝、免疫分化以及保護(hù)機(jī)體免受病原體的侵害等多個(gè)方面，并發(fā)揮著重要的功能。然而腸道菌群很容易受到外界因素的干擾，譬如飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣改變、益生菌和抗生素的應(yīng)用等等，其中最被我們所熟知也是影響最為顯著的就是抗生素?？股刈鳛橐环N殺菌藥物自發(fā)現(xiàn)以來一直廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等各種領(lǐng)域，然而其濫

2、用不僅會(huì)加劇耐藥性病原菌的傳播和轉(zhuǎn)移，同樣會(huì)破壞人體與菌群的相互關(guān)系。腸道菌群一旦紊亂將會(huì)導(dǎo)致一系列的功能性障礙和疾病，例如肥胖、腹瀉、炎癥性腸炎(IBD)、糖尿?。á裥秃廷蛐停?、大腸癌、自閉癥、哮喘等等。認(rèn)清腸道菌群是如何影響人體的健康與疾病，需要我們將關(guān)注點(diǎn)從過去只針對(duì)個(gè)別的病原體，轉(zhuǎn)移以整體的角度研究菌群上來，特別是闡明正常的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)以及當(dāng)疾病發(fā)生時(shí)它們有何異常的差異。
　　 利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rRN

3、A進(jìn)行檢測(cè)，具有通量高，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，能夠顯著的改善傳統(tǒng)微生物研究方法的不足，獲得比較理想的微生物群落數(shù)據(jù)，為我們研究微生物生態(tài)學(xué)奠定了良好的方法學(xué)基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1、探求糞便總細(xì)菌基因組DNA高通量提取方法。建立不同濃度的煮沸法提取大鼠糞便基因組總DNA，并與常用商業(yè)DNA提取試劑盒法進(jìn)行比較，通過分析不同DNA提取方法的α、β多樣性以及菌群結(jié)構(gòu)，并重點(diǎn)比較他們中高豐度水平的OTU的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以揭示不同

4、DNA提取方法之間的異同，從而尋找快速、經(jīng)濟(jì)、高效、穩(wěn)定的DNA提取方案，為后期的研究分析奠定基礎(chǔ)。
　　 2、比較不同給藥方式對(duì)小鼠腸道菌群的影響。選擇第三代頭孢菌素頭孢噻肟鈉，對(duì)BALB/C小鼠使用皮下注射和飲水口服兩種給藥方式同時(shí)給藥，并收集給藥前期、給藥中期、停藥后期三階段的糞便樣品，通過對(duì)不同給藥階段以及不同給藥方式的小鼠的腸道菌群進(jìn)行比較，評(píng)估頭孢噻肟鈉不同給藥方式對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)以及多樣性的影響，并追溯其停藥后的

5、恢復(fù)過程。3、比較不同抗生素對(duì)小鼠腸道菌群的影響。選擇四大類共六種抗生素，分別是β-內(nèi)酰胺類（頭孢曲松鈉、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、美羅培南）、喹諾酮類（左氧氟沙星）、糖肽類（萬古霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素），對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行皮下注射給藥，并收集給藥前期、給藥中期、停藥后期三階段的糞便樣品，評(píng)價(jià)不同類型的抗生素，以及同類型的不同藥物對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的作用，并比較停藥后各自的恢復(fù)過程，擬探討抗生素對(duì)腸道菌群的影響，并為尋求耐藥

6、機(jī)制提供線索，同時(shí)為我們探索抗生素長期或是反復(fù)作用提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、我們于成年健康SD大鼠肛門，直接收集新鮮糞便置于滅菌的5ml離心管中，-80℃冷凍保存。分別采用直接煮沸法:以0.5ml無菌EP管取1mg(Boil.1)、3mg(Boil.3)、5mg(Boil.5)、10mg(Boil.10)、30mg(Boil.30)鼠糞，分別加入100ul無菌ddH2O后振蕩均勻，先后經(jīng)過100℃15min

7、，0℃10min。最后經(jīng)13000xg4℃離心5min后，取上清置于新的干凈離心管中，作為DNA模板。商業(yè)試劑盒法:選取MO BIO UltraClean Fecal DNA Isolation Kit(MO BIO)、Qiagen QIAmp DNA mini KIT(Qiagen)、TIANGEN TIANamp Stool DNA kit(TG)、BIOEASY糞便總DNA磁珠法提取試劑盒(BMag)、BIOEASY細(xì)菌/細(xì)胞/動(dòng)

8、物組織基因組DNA過柱法(BCL)共五種常用商業(yè)試劑盒，按照各試劑盒說明說提取大鼠糞便總DNA，并溶于50ul TE緩沖液中。所有提取DNA模板置于-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、我們將24只雄性BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組（8只/組），保證每組小鼠的體重分布相一致。在預(yù)養(yǎng)一周后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠分別以皮下注射(CTX.i)與自然飲水口服(CTX.o)的方式進(jìn)行為期4天的短期頭孢噻肟鈉給藥，對(duì)照組(CK)小鼠不做任何處理。分別收集各組

9、小鼠給藥前期(Ⅰ.1、Ⅰ.2、Ⅰ.3)，給藥中期(Ⅱ.1、Ⅱ.2、Ⅱ.3、Ⅱ.4)，停藥后期(Ⅲ.1、Ⅲ.2、Ⅲ.3、Ⅲ.4、Ⅲ.、Ⅲ.6、Ⅲ.7、Ⅲ.14、Ⅲ.30、Ⅲ.90)三個(gè)時(shí)期的糞便樣品，所有的樣品取樣后立即置于-80℃冷凍保存。根據(jù)體重記錄，每組除去體重偏離中位數(shù)最遠(yuǎn)的2只小鼠，對(duì)剩余6只小鼠的糞便進(jìn)行DNA提取。
　　 3、我們將56只雄性BALB/C小鼠隨機(jī)分為7組（8只/組），保證每組小鼠的體重分布相一致。在預(yù)

10、養(yǎng)一周后，對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行為期的3天的短期給藥。各組小鼠按照編號(hào)分別皮下注射頭孢曲松鈉(CTR)、鹽酸左氧氟沙星(OFL)、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(CPZ)、萬古霉素(VAN)、美羅培南(MEC)、阿奇霉素(AZI)，對(duì)照組(CK)小鼠注射等體重比的生理鹽水。分別收集給藥前期(Ⅰ.1、Ⅰ.2)，給藥中期(Ⅱ.1、Ⅱ.2、Ⅱ.3)，停藥后期(Ⅲ.1、Ⅲ.2、Ⅲ.3、Ⅲ.4、Ⅲ.、Ⅲ.6、Ⅲ.7、Ⅲ.14、Ⅲ.30、Ⅲ.90)三個(gè)時(shí)期的糞便樣

11、品，所有的樣品取樣后立即置于-80℃冷凍保存。根據(jù)體重記錄，每組除去體重偏離中位數(shù)最遠(yuǎn)的2只小鼠，對(duì)剩余6只小鼠的糞便進(jìn)行DNA提取。
　　 我們以16s rRNA V6區(qū)域帶barcode的通用引物對(duì)所有提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過混合、純化之后送至華大基因公司以IlluminaHiseq2000測(cè)序儀進(jìn)行PE75測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)我們采用barcoded Illuminapaired-end sequenc

12、ing(BIPES)分析流程進(jìn)行提取和初步處理，使用UCHIME篩選去除嵌合體;所得干凈序列經(jīng)Two-Stage-Clustering(TSC)以97％的相似度聚類成OTU（Operational Taxonomic Unit），并采用Global Alignment forSequence Taxonomic(GAST)算法對(duì)其進(jìn)行分類;采用mothur來獲得樣品的α多樣性信息;基于UniFrac距離，采用QIIME進(jìn)行主成分分析;采

13、用lineardiscriminant analysis(LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在線工具尋找有組與組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、采用直接煮沸法直接提取糞便樣品DNA，所得到的菌群結(jié)構(gòu)與使用商業(yè)試劑盒類似。當(dāng)采用較少量的糞便樣品進(jìn)行直接煮

14、沸法提取DNA時(shí)，會(huì)造成α多樣性被低估，然而當(dāng)糞便樣品量達(dá)到10-30mg時(shí)，所得到的僅多樣性結(jié)果與采用200mg糞便進(jìn)行提取的商業(yè)試劑盒相一致。β多樣性與菌群結(jié)構(gòu)的分析表明，直接煮沸法與除MO BIO之外的大部分試劑盒結(jié)果相一致。此外，幾乎所有中高豐度的OTU在所有的方法，包括直接煮沸法和試劑盒法中，都能夠被檢測(cè)到，這表明我們可以選用一致的方法更為有效的研究OTU在時(shí)間和空間上的變化。直接煮沸法僅使用少量的糞便(如10mg)，能夠最大

15、程度的降低對(duì)樣品量的需求，更適用于一些珍貴或取樣量較少的樣品，并且能顯著降低DNA提取的成本以及提高提取效率，為制備大批量樣品提供了新的解決之路，這對(duì)我們后續(xù)的研究起著重要的作用。
　　 2、經(jīng)頭孢噻肟鈉給藥的小鼠其腸道菌群的α多樣性從給藥第二天開始出現(xiàn)顯著性下降，這種低水平的α多樣性并沒有隨著頭孢噻肟鈉的停用而立刻恢復(fù)，而是持續(xù)了兩周的時(shí)間。而β多樣性同樣給我們展示了頭孢噻肟鈉對(duì)小鼠腸道菌群所造成的劇烈影響，這種菌群結(jié)構(gòu)上的改

16、變比起α多樣性來更為持久和難以恢復(fù)，在停藥后兩周的時(shí)間點(diǎn)上依然存在著顯著性差異。由此可得知，哪怕只是短時(shí)間的正常用藥，頭孢噻肟鈉也會(huì)對(duì)小鼠腸道菌群造成嚴(yán)重的影響，這種影響同時(shí)體現(xiàn)在α和β多樣性上，并遠(yuǎn)比我們想象中漫長。通過采用LEfSe對(duì)生物標(biāo)志物的尋找，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)頭孢噻肟鈉給藥的小鼠，其腸道內(nèi)微生物在門水平上Bacteroidetes，Proteobacteria和Actinobacteria幾乎完全消失，而Firmicutes大量滋

17、生。特別是對(duì)于有益菌Lactobacillus造成了災(zāi)難性的破壞，并恢復(fù)過程緩慢;而Clostridium，Bacillus和Enterococcus相對(duì)于對(duì)照組正常小鼠有著顯著性的增加。這種群落多樣性下降而Clostridum水平上升與艱難梭菌腹瀉(CDAD)，特別是復(fù)發(fā)性CDAD相關(guān)。另一方面，口服給藥法給小鼠腸道細(xì)菌的總量造成了嚴(yán)重的影響，導(dǎo)致PCR以及后期測(cè)序所得序列均較不理想。但是從未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化序列進(jìn)行UniFrac的結(jié)果以及所

18、有能夠分析的數(shù)據(jù)上，我們可以看到注射和口服兩種給藥途徑對(duì)小鼠腸道菌群造成影響的趨勢(shì)基本是相似的。這予我們啟示，即為了保證后期測(cè)序分析的質(zhì)量，在同時(shí)存在口服和注射給藥途徑的情況下可以首選注射給藥。
　　 3、本研究表明，所有的抗生素都會(huì)對(duì)小鼠腸道菌群α多樣性造成影響，其中OFL與AZI對(duì)小鼠腸道菌群α多樣性的影響相對(duì)較輕微，在停藥后第4天均已恢復(fù)到正常水平;而CTR、CPZ、VAN與MEC對(duì)α多樣性影響則更為相似，在停藥后兩周才基

19、本恢復(fù)正常。從β多樣性的角度來看，OFL與AZI對(duì)小鼠腸道菌群的影響并不是十分顯著，CTR組、CPZ組、VAN組與MEC組的腸道菌群則都在給藥的第二天發(fā)生了劇烈的變化。并且不同的抗生素對(duì)于不同豐度的OTU的具有選擇性作用，CTR、CPZ和MEC這三種藥物主要作用于腸道菌群中一些豐度不高的OTU上，VAN組則更多地作用于一些中高豐度的OTU上。另一方面，隨著藥物的停用，不同的抗生素也表現(xiàn)出不同的恢復(fù)趨勢(shì)。CTR組與MEC組的腸道菌群到停藥

20、后第14天才恢復(fù)到正常，而CPZ組到停藥后第30天才恢復(fù)，VAN組更是直到停藥后第90天才完全恢復(fù)正常。
　　 從菌群結(jié)構(gòu)上我們可以發(fā)現(xiàn)，在門水平級(jí)別上，β-內(nèi)酰胺類的抗生素組的三種藥物變化更為相似，均以抗生素作用下Firmicutes增加，Bacteroidetes與Proteobacteria減少為特征;然而具體三種藥物的作用仍有一定的區(qū)別，CPZ組Firmicutes水平的升高主要發(fā)生于停藥后期，而CTR與MEC主要發(fā)生于

21、給藥中期。OFL組與AZI組變化呈現(xiàn)輕微的波動(dòng)但不明顯，OFL組可以觀察到Proteobacteria水平隨著給藥開始下降，并直到觀察期結(jié)束依然保持著較低水平。VAN組顯現(xiàn)出明顯異于其他給藥組的菌群變化，即Firmicute水平隨著給藥大幅度下降，而Proteobacteria則占據(jù)了小鼠腸道菌群中的主導(dǎo)地位。進(jìn)一步從屬水平上可以發(fā)現(xiàn)，只有VAN組反常的在給藥中期出現(xiàn)了Escherichia增高的情況，造成這點(diǎn)的原因主要是由于萬古霉素的

22、殺菌譜重點(diǎn)偏向于殺滅革蘭氏陽性菌，從而造成革蘭氏陰性菌的定植與增生。而VAN組在停藥2周之后，Clostridium水平略有增加，并在整個(gè)觀察期結(jié)束時(shí)仍未恢復(fù)，我們推測(cè)此為VAN對(duì)小鼠腸道菌群的所造成遠(yuǎn)期影響之一。喹諾酮類藥物OFL對(duì)小鼠腸道菌群的影響相對(duì)較輕微，為我們臨床用藥選擇提供了指導(dǎo)和借鑒。大環(huán)內(nèi)酯類藥物AZI主要作用于Bacteroidetes門的細(xì)菌，并對(duì)于豐度較低的菌屬影響較大。此外，三種β-內(nèi)酰胺類藥物的抗生素(CTR、

23、CPZ、MEC)在殺菌譜上表現(xiàn)出了一定的一致性，都是以殺滅Firmicutes和Bacteroidetes為主的菌群并造成Clostridium大量增生，這點(diǎn)在其他類型的抗生素上并未有相似表現(xiàn)。綜合前研究頭孢噻肟鈉我們可以發(fā)現(xiàn)驚人的一致性，這種多樣性降低而Clostridium增長的趨勢(shì)有可能β-內(nèi)酰胺類抗生素易導(dǎo)致艱難梭菌感染的一個(gè)重要原因。盡管如此，β-內(nèi)酰胺的三種抗生素有他們各自的作用特點(diǎn)，譬如CTR組與MEC組的Clostrid

24、ium水平隨著藥物的給予立即上升，而CPZ組的Clostridium水平最高峰反而出現(xiàn)在停藥后期，其恢復(fù)過程也不盡相同。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究建立了糞便直接煮沸法，并證明了其與普通商業(yè)試劑盒法無顯著差異，為后期實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚩焖佟⒂行?、?jīng)濟(jì)的對(duì)大批量樣品進(jìn)行DNA提取提供了基礎(chǔ)。
　　 2、盡管只是短期用藥，頭孢噻肟鈉依然會(huì)對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性造成嚴(yán)重的影響，并且這一影響隨著藥物的停用依然會(huì)持續(xù)較長一段