刺參菌群結(jié)構(gòu)的分析及益生菌對刺參的影響.pdf

1、刺參（Apostichopus japonicas，Selenka）是中國最具有商業(yè)價值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，但是對刺參的基礎(chǔ)研究還處于初級階段，尤其是與刺參病害息息相關(guān)的茵群組成特點成為迫切研究的對象。水產(chǎn)生物的菌群環(huán)境對其生長具有很重要的作用，明確刺參菌群結(jié)構(gòu)的特點，有助于防治刺參的病害以及篩選適合于自身的土著益生菌。隨著刺參集約化、規(guī)?；母呙芏瑞B(yǎng)殖模式，抗生素和激素的大量濫用，新的致病菌和耐藥菌的不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致了生態(tài)環(huán)境的破壞和食

2、品安全等問題。水產(chǎn)益生菌作為一種無公害綠色飼料添加劑及凈水劑，可以有效的替代或減少抗生素類等藥物使用，以提高水產(chǎn)動物健康為目的，廣泛的應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。本文考察了不同養(yǎng)殖季節(jié)環(huán)境中及飼喂不同的藻類餌料，刺參腸道、養(yǎng)殖水體和池塘底泥中菌群結(jié)構(gòu)的特點。依據(jù)菌群特點，從刺參腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中分離了兩株益生乳酸菌和三株益生芽孢桿菌，分析了乳酸菌在刺參腸道粘膜抑制病原弧菌的機理，檢測了芽孢桿菌對刺參生長、免疫及養(yǎng)殖水體凈化等方面的益生作用，最后優(yōu)

3、化了芽孢桿菌的液體發(fā)酵條件和培養(yǎng)基，為刺參的綠色生態(tài)養(yǎng)殖提供了理論和實踐基礎(chǔ)。
　　論文主要工作如下:
　　(1)結(jié)合變性梯度凝膠電泳技術(shù)和限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)，研究了在不同養(yǎng)殖季節(jié)環(huán)境中及喂食不同的藻類餌料時，刺參腸道、養(yǎng)殖水體和池塘底泥中菌群結(jié)構(gòu)的特點。結(jié)果表明:在不同的養(yǎng)殖季節(jié)中，刺參腸道、養(yǎng)殖水體和池塘底泥中菌群結(jié)構(gòu)有較少差別;飼喂鹽藻、新月藻及這兩種等量混合的藻類，對刺參幼蟲、養(yǎng)殖水體和底泥樣本的菌群結(jié)構(gòu)也有比

4、較小的影響，刺參菌群組成相對穩(wěn)定。γ-變形桿菌和α-變形桿菌的菌屬是出現(xiàn)最多的菌群，其次是β-變形桿菌、ε-變形桿菌等。主要菌群包括玫瑰桿菌屬、弧菌屬、斯瓦尼菌屬、黃桿菌屬、腸桿菌屬、氣單胞菌屬、不動桿菌屬、屈橈桿菌屬、芽孢桿菌屬、噬纖維菌屬、假單胞菌屬、擬桿菌菌屬、紅細(xì)菌科和其它的海洋細(xì)菌;弧菌屬和玫瑰桿菌屬存在于所有的樣本中。這些結(jié)果可以為發(fā)展刺參細(xì)菌分子分析和刺參益生菌的篩選提供基礎(chǔ)。
　　(2)從刺參的養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選得

5、到三株芽孢桿菌和兩株乳酸菌，均具有較強的拮抗病原弧菌作用。通過菌落形態(tài)分析、常規(guī)生理生化和16S rRNA基因序列同源性鑒定，初步確定三株芽孢桿菌分別為枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和彎曲芽孢桿菌;兩株乳酸菌為嗜酸性乳酸桿菌。它們對溫度、pH、膽鹽具有良好耐受性，可將其制備成復(fù)合微生態(tài)制劑應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖中。
　　(3)分析了嗜酸性乳酸桿菌RS-1和RS-2對刺參的益生作用。首先確定了乳酸桿菌RS-1和RS-2對刺參粘膜的附著力、粘膜的

6、滲透性，病原菌生長和附著的抑制作用，以及對刺參腸道生長環(huán)境的適應(yīng)性。結(jié)果表明，嗜酸性乳酸桿菌RS-1和RS-2不能抑制病原弧菌的黏附，但是乳酸菌可以分泌抑制物質(zhì)，通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)的作用方式，明顯的抑制了病原弧菌的生長。乳酸菌RS-1和RS-2可以作為一種安全有效的手段進(jìn)行刺參活體抑菌實驗的研究。
　　(4)通過攻毒試驗，測定體腔細(xì)胞、免疫相關(guān)酶、消化酶和生長表現(xiàn)等指標(biāo)?？疾炝藦?fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2對刺參免疫和生長的作用效果

7、。結(jié)果表明，在試驗的第16天和32天后，高劑量益生菌組的刺參免疫性能與對照組相比明顯增強(P＜0.05);攻毒試驗表明，可控組的累積死亡率是100％，而高劑量益生菌組的累積死亡率是47％(P＜0.05)，復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2可以有效的控制病原弧菌的感染;高劑量益生菌組的刺參有最高的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，而最低的是對照組(P＜0.05)，復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2明顯的促進(jìn)了海參的生長和飼料的轉(zhuǎn)化率。腸道中總的異養(yǎng)菌數(shù)

8、沒有受到復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2的影響，但芽孢桿菌數(shù)卻明顯增多，復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2可以調(diào)節(jié)刺參腸道菌群的平衡。
　　(5)分析了復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2對刺參養(yǎng)殖水體的凈化作用。結(jié)果表明，經(jīng)過21天高劑量益生菌水質(zhì)調(diào)節(jié)后，養(yǎng)殖池氨氮平均值為0.44 mg l-1，亞硝氮平均值為0.10 mg l-1，硫化氫平均值為0.16 mg l-1，COD維持在4.77 mg l-1以下，UV254維持在0.046cm

9、-1以下，透明度維持在0.4 m以下，復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2有效的凈化了養(yǎng)殖水體。
　　(6)針對復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2的生長營養(yǎng)需求，優(yōu)化了發(fā)酵工藝并獲得了高效率的培養(yǎng)營養(yǎng)基。結(jié)果表明，復(fù)合芽孢桿菌YB-1和YB-2小試發(fā)酵的最佳碳源、氮源、磷源分別為玉米淀粉+甜蜜、蛋白胨、NaH2PO4;最佳發(fā)酵條件是初始pH值7.8，接種量7％，溫度35℃，培養(yǎng)周期24 h，得到的活菌數(shù)可達(dá)到2.3×109 cfu ml-1