PEDF對(duì)缺血心肌中VEGF表達(dá)及血管再生的影響.pdf

1、目的：色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一種強(qiáng)力的血管再生抑制因子，PEDF能抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial cellgrowth factor，VEGF)，影響血管生成(angiogenesis)。本研究分別將siPEDF-LV和PEDF-LV轉(zhuǎn)染大鼠梗死心肌，抑制或過(guò)表達(dá)PEDF，觀察對(duì)缺血心肌VEGF的表達(dá)及血管再生的影響。為進(jìn)一步完善

2、缺血心臟病基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：成年SD大鼠，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，建立心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。?gòu)建siPEDF-LV和PEDF-LV病毒載體，采用心肌直接注射方法轉(zhuǎn)染至缺血心肌組織。
　　實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為6組：A組(正常組)：正常大鼠；B組(siPEDF表達(dá)組)：梗死心肌缺血轉(zhuǎn)染siPEDF-LV和Ehanced-Infection-Solution混合液(1:9)；C組(PEDF過(guò)表達(dá)組)：梗死心肌轉(zhuǎn)染PEDF-LV

3、Ehanced-Infection-Solution混合液；D組(載體對(duì)照組)：梗死心肌局部注射同等劑量NC-RNA-LV和Ehanced-Infection-Solution混合液；E組(溶劑對(duì)照組)：梗死心肌注射同等劑量生理鹽水；F組(單純梗死組)：?jiǎn)渭冃泄跔顒?dòng)脈結(jié)扎不注射任何試劑。
　　模型建立4周后，免疫熒光及Western blot檢測(cè)PEDF、VEGF、HIF-1α及TNF-α蛋白表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)VEGFR-

4、2陽(yáng)性新生血管(Tip cell)數(shù)量，免疫熒光方檢測(cè)Fitc-LectinB4及α-SMA陽(yáng)性血管數(shù)量，HE染色檢測(cè)心肌梗死區(qū)域炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)果：1大鼠心肌梗死模型建立及檢測(cè)
　　結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后，心肌顏色由鮮紅變?yōu)榘底仙CG顯示，結(jié)扎后ST段弓背向上，心肌梗死模型建立成功。Masson三色染色顯示，正常心肌細(xì)胞呈紅色，梗死區(qū)瘢痕膠原纖維呈藍(lán)色。
　　2梗死心肌內(nèi)源性PEDF和VEGF表達(dá)
　　W

5、estern blot和免疫熒光雙標(biāo)顯示：正常大鼠心肌中內(nèi)源性PEDF蛋白高表達(dá)，心肌梗死后，內(nèi)源性PEDF蛋白表達(dá)降低，6周時(shí)達(dá)最低點(diǎn)，之后逐漸回升。正常心肌內(nèi)源性VEGF蛋白表達(dá)較少，心肌梗死后，表達(dá)開(kāi)始升高，6周時(shí)達(dá)最高峰，之后逐漸下降。
　　心肌梗死后0-12周，內(nèi)源性PEDF和VEGF表達(dá)呈反向趨勢(shì)。
　　3病毒轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)
　　siPEDF組、PEDF過(guò)表達(dá)組、載體對(duì)照組可檢測(cè)到綠色GFP蛋白表達(dá)，正常組、

6、溶劑對(duì)照組及單純手術(shù)組中未檢測(cè)GFP蛋白表達(dá)。
　　Western blot和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：心梗后1周，與正常組、載體對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及單純梗死組相比，siPEDF組PEDF表達(dá)量降低(P<0.05)，PEDF過(guò)表達(dá)組PEDF表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4梗死心肌中蛋白檢測(cè)結(jié)果
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：模型建立4周時(shí)，與正常組、載體對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及單純梗死組相

7、比，siPEDF組PEDF蛋白表達(dá)降低，VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著增多。PEDF過(guò)表達(dá)組PEDF表達(dá)明顯升高，VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5 PEDF對(duì)梗死心肌血管再生的影響
　　新生血管檢測(cè)結(jié)果顯示：模型建立4周時(shí)，與正常組、載體對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及單純梗死組相比，siPEDF組VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)。PEDF過(guò)表達(dá)組VEGFR2陽(yáng)性

8、細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　免疫熒光結(jié)果顯示：模型建立4周時(shí)，與載體對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及單純梗死組相比，siPEDF組Fitc-LectinB4陽(yáng)性血管數(shù)量顯著增加(P<0.05)，PEDF過(guò)表達(dá)組Fitc-LectinB4陽(yáng)性的血管數(shù)量顯著減少(P<0.05)。siPEDF組及PEDF過(guò)表達(dá)組α-SMA陽(yáng)性的血管數(shù)量與載體對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及單純梗死組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

9、　　6炎癥因子檢測(cè)
　　模型建立4周時(shí)，與載體對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及單純梗死組相比，siPEDF組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增多，TNF-α表達(dá)顯著增加(P<0.05)。PEDF過(guò)表達(dá)組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，TNF-α表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1、大鼠心肌梗死后0-12周期間，內(nèi)源性PEDF和VEGF表達(dá)呈反向趨勢(shì)。
　　2、抑制梗死心肌中PEDF表達(dá)，HIF-1α及VEGF表達(dá)升高；PEDF過(guò)表達(dá)，