PEDF基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其對大鼠心肌血管生成的影響.pdf

1、目的：本研究通過構(gòu)建PEDF基因重組慢病毒載體，將其轉(zhuǎn)染至大鼠心肌以調(diào)節(jié)PEDF表達(dá)，探討PEDF對正常大鼠心肌血管生成中的作用。
　　方法：構(gòu)建大鼠過表達(dá)PEDF和PEDF-siRNA重組慢病毒；實(shí)驗(yàn)動物分為六組：正常組(A)、過表達(dá)組(B)、干擾組(C)、載體對照組(D)、假手術(shù)組(E)、梗死組(F)；采用分點(diǎn)注射法轉(zhuǎn)染PEDF過表達(dá)載體和PEDF-siRNA表達(dá)載體至大鼠心臟左室心肌組織，通過調(diào)控(干擾或過表達(dá))大鼠心肌局部

2、PEDF表達(dá)，檢測PEDF轉(zhuǎn)染局部心肌組織血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白表達(dá)的變化。通過檢測血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial cell growth fa

3、ctor receptor2，VEGFR2)陽性細(xì)胞數(shù)量和α-SMA陽性血管數(shù)量，觀察PEDF對心肌血管生成的影響。
　　結(jié)果：1.PEDF過表達(dá)和PEDF-SiRNA質(zhì)粒鑒定
　　PEDF過表達(dá)質(zhì)?？捎行н^表達(dá)PEDF蛋白；PEDF-siRNA質(zhì)?？捎行Ц蓴_PEDF蛋白表達(dá)，質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2.病毒滴度檢測
　　重組病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Real-time PCR測定病毒滴度為2.00E+9TU/ml。

4、
　　3.動物模型的建立和基因轉(zhuǎn)染
　　大鼠心臟左室前壁注射各組試劑后觀察，心電圖示未心肌損傷性改變；梗死組結(jié)扎冠狀動脈左前降支后，肉眼觀察缺血心肌局部顏色變紫，心電圖描記術(shù)后ST段弓背向上抬高。
　　美藍(lán)注射實(shí)驗(yàn)證明試劑可浸潤心肌全層，心肌注射方法可用于基因轉(zhuǎn)染。熒光顯微鏡下觀察，過表達(dá)組、干擾組及載體對照組可于轉(zhuǎn)染局部觀察到GFP綠色熒光，而其他各組無GFP表達(dá)。
　　4.VEGF、VEGFR2、TNF-α和

5、HIF-1α基因表達(dá)的檢測
　　RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，干擾組PEDF表達(dá)明顯下降，而過表達(dá)組PEDF上升(P<0.05)，其余各組同正常組無顯著差異；干擾組VEGF、VEGFR2和TNF-α表達(dá)升高(P<0.05)，而過表達(dá)組VEGF、VEGFR2和TNF-α表達(dá)降低(P<0.05)，其余各組VEGF、VEGFR2和TNF-α同正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除單純梗死組HIF-1α蛋白有所升高外，

6、其余各組HIF-1α mRNA/蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.轉(zhuǎn)染心肌局部炎癥細(xì)胞的檢測
　　HE染色顯示，與正常組相比，干擾組轉(zhuǎn)染局部中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.轉(zhuǎn)染心肌局部血管生成的檢測
　　免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，干擾組VEGFR2(新生血管)陽性血管顯著增加(P<0.05)，而過表達(dá)組VEGFR2明顯減少(

7、P<0.05)，正常組、假手術(shù)組及載體組同正常組無顯著差異。各組α-SMA陽性血管數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：1.PEDF-SiRNA-lentivirus和PEDF-lentivirus構(gòu)建成功，可有效調(diào)控大鼠心肌PEDF蛋白表達(dá)。
　　2.在心肌組織中，PEDF通過調(diào)VEGF和VEGFR2表達(dá)，影響心肌血管生成，但對已存在血管無調(diào)節(jié)作用。
　　3.非缺氧條件下，PEDF對VEGF的調(diào)控并非HI