亞臨床甲減患者血漿及LDL氧化脂肪酸液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)及臨床意義.pdf

1、亞臨床甲狀腺功能減退癥是指血清促甲狀腺激素(TSH)水平增高，而血清游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)正常的一種病理狀態(tài)。大多數(shù)專(zhuān)家認(rèn)同亞臨床甲減系早期的、輕度的甲狀腺功能減退。根據(jù)血清TSH水平，亞臨床甲減可分為輕度亞臨床甲減（TSH濃度介于4.5～10 mU/L）和重度亞臨床甲減(TSH≥10mU/L)。在一些前瞻性的隊(duì)列研究中報(bào)道亞臨床甲減與心血管疾病發(fā)病率及死亡率增加密切相關(guān)，這些可能與在亞臨床甲減患者中存在的

2、致動(dòng)脈粥樣硬化血脂譜有關(guān);有系列報(bào)道在亞臨床甲減患者中總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯水平升高，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低。然而，盡管在亞臨床甲減患者中可能存在上述脂質(zhì)異常，但這也許并不能全部解釋亞臨床甲減患者中動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)病率的增加，可能還有其它致病因素的參與。在亞臨床甲減患者中脂質(zhì)譜的改變往往導(dǎo)致低密度脂蛋白(LDL)氧化易感性的改變;眾所周知，氧化型LDL在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)

3、病中有著重要作用。Diekman等報(bào)道在甲減患者中由于缺少甲狀腺素(T4)的抗氧化保護(hù)，循環(huán)中的LDL易于發(fā)生過(guò)氧化;然而，在亞臨床甲減患者中關(guān)于LDL的氧化易感性改變相關(guān)研究和報(bào)道較少。
　　LDL氧化是一系列復(fù)雜的過(guò)程，牽涉較多的氧化通路，其中一重要的途徑是通過(guò)脂氧合酶(LOX)通路發(fā)生氧化，產(chǎn)生過(guò)氧羥基廿碳四烯酸(HPETE)和過(guò)氧羥基十八碳二烯酸(HPODE)。這些HPETE和HPODE隨之被還原為對(duì)應(yīng)的羥基衍生物羥基廿碳

4、四烯酸(HETE)和羥基十八碳二烯酸(HODE);在LDL中亞油酸(LA)和花生四烯酸(AA)的氧化對(duì)應(yīng)著各自形成HODE和HETE。這些HETE和HODE在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)有的脂質(zhì)過(guò)氧化研究以針對(duì)花生四烯酸居多，關(guān)于亞油酸氧化的研究和報(bào)道相對(duì)較少，盡管亞油酸為L(zhǎng)DL中最主要的多不飽和脂肪酸(PUFA)。除了對(duì)LDL的研究外， Rago等用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)了一組冠心病患者和正常對(duì)照血漿中的18個(gè)主要類(lèi)

5、花生酸類(lèi)產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在冠心病患者血漿中9-HODE、13-HODE、8-HETE和白三烯B4(LTB4)的水平反而較正常對(duì)照組明顯降低，可能為心臟病嚴(yán)重程度的負(fù)性標(biāo)志物。目前關(guān)于亞臨床甲減患者LDL或血漿中亞油酸和花生四烯酸氧化應(yīng)激產(chǎn)物——HODE、HETE水平的變化及其與亞臨床甲減病情及動(dòng)脈粥樣硬化輕重程度的關(guān)系尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　目的:
　　考慮到亞臨床甲減可增加動(dòng)脈粥樣硬化和心血管病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物

6、（主要是HETE和HODE）可能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病中有著重要的作用，因此本研究擬:
　　1、比較輕、重度亞臨床甲減患者與正常對(duì)照組血漿和LDL中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物——HODE和HETE表達(dá)水平的差異，以評(píng)價(jià)亞臨床甲減患者氧化應(yīng)激狀況;
　　2、探討脂質(zhì)過(guò)氧化、TSH水平和亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)——頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(intima-media thickness，IMT)三者之間的潛在聯(lián)系，了解亞臨床甲減患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增

7、加的潛在機(jī)制;
　　3、比較血漿與LDL中HODEs、HETEs表達(dá)水平的差異，了解其在反映動(dòng)脈硬化程度敏感性和特異性上的差異，力圖尋找一個(gè)比IMT更佳的替代標(biāo)志物來(lái)反映動(dòng)脈粥樣硬化。
　　對(duì)象:
　　亞臨床甲減的診斷標(biāo)準(zhǔn)基于血清TSH水平高于正常值上限，而血清FT4正常;根據(jù)TSH升高的程度，亞臨床甲減患者進(jìn)一步分為輕度(TSH水平介于4.5～10 mU/L)和重度（TSH≥10 mU/L）。研究對(duì)象來(lái)自山東省寧陽(yáng)縣

8、2013年1月至2013年2月流調(diào)人群（n=1331），嚴(yán)格按照既定的入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，有160名患者初步診斷為亞臨床甲減，半年后復(fù)查甲狀腺功能以排除實(shí)驗(yàn)室誤差及TSH的暫時(shí)性升高等，有129名患者二次檢測(cè)結(jié)果均符合亞臨床甲減的診斷并最終診斷為亞臨床甲減，在這些患者中應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法最終隨機(jī)挑選10例輕度亞臨床甲減患者及10例年齡、性別匹配的重度亞臨床甲減患者;正常對(duì)照組選自同一流調(diào)人群，嚴(yán)格按照排除標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)病史詢(xún)問(wèn)、體格檢查、心電圖和

9、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查等排除患任何疾病，亦間隔半年重復(fù)測(cè)量二次甲狀腺功能均正常后初篩入選200名，采用隨機(jī)數(shù)字表法選擇10名作為正常對(duì)照組，年齡、性別均匹配。
　　方法:
　　1、收集每個(gè)研究對(duì)象基本臨床資料;超聲測(cè)量頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度;留取血標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)生化指標(biāo)及甲狀腺功能檢測(cè);留取部分血漿加入抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)后-80℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)的LDL分離及質(zhì)譜檢測(cè);
　　2、快速蛋白液相色譜法(

10、Fast Performance Liquid Chromatograhy，F(xiàn)PLC)分離血漿LDL:先收集FPLC各組分后應(yīng)用血總膽固醇和甘油三酯試劑盒分別測(cè)定各組分總膽固醇和甘油三酯濃度，從而鑒定LDL峰所在位置，再定向收集LDL;用試劑盒測(cè)定LDL基本參數(shù);
　　3、摸索質(zhì)譜條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將血漿和LDL樣品分別經(jīng)前處理提取脂質(zhì)后應(yīng)用Thermo Vantage三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-ESI-MS)分別檢測(cè)血漿及LD

11、L中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物HODE和HETE的含量。
　　統(tǒng)計(jì)分析:
　　本實(shí)驗(yàn)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料均以(X)±s表示，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較;方差不齊或非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行因素間的相關(guān)分析。
　　

12、結(jié)果:
　　1、各組間臨床基線(xiàn)資料的比較
　　重度SCH組LDL-C和mean-IMT水平較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，而在輕度SCH組LDL-C和mean-IMT水平與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;三組間年齡、性別、BMI、收縮壓和舒張壓、空腹血糖、TC、HDL-C和甘油三酯水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　在LDL中，TC濃度在正常對(duì)照組、輕度SCH及重度SCH組中呈逐步升

13、高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;TG濃度在三組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2、TSH水平與mean-IMT的相關(guān)性分析
　　在所有研究對(duì)象中，TSH水平與mean-IMT呈顯著正相關(guān)(r=0.401，P=0.028);即使在矯正年齡、性別、TC、 HDL-C，LDL-C和TG后兩者仍呈顯著正相關(guān)（r=0.480，P=0.018），此結(jié)果在一定程度上揭示了亞臨床甲減患者隨著TSH水平升高，動(dòng)脈粥樣硬

14、化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。
　　3、亞臨床甲減患者脂質(zhì)過(guò)氧化水平的比較
　　無(wú)論是在血漿還是LDL中，重度SCH組9-HODE和13-HODE水平均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05或＜0.01)，而輕度SCH組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);重度SCH組血漿9-HODE水平較輕度SCH組亦顯著升高(P＜0.01)。重度SCH組血漿5-HETE水平較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，而輕度SCH組與正常對(duì)照組比較

15、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;血漿12-HETE的濃度，在輕度和重度SCH組均較正常對(duì)照組顯著升高（分別P＜0.05和0.01），而重度SCH組與輕度SCH組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同于血漿，在LDL中5-，12-和15-HETE水平在三組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、LDL中HODE水平與TSH的相關(guān)性分析
　　Spearman's相關(guān)分析顯示LDL中9-HODE和13-HODE水平均與TSH呈顯著正相關(guān)（分別

16、r=0.376、P=0.041，和r=0.447，P=0.013），提示隨著TSH水平的升高LDL中脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著增加。
　　5、血漿與LDL中HODEs及HETEs水平在反映動(dòng)脈硬化程度上敏感性的比較
　　把研究對(duì)象根據(jù)max-IMT水平分為正常組（max-IMT≤0.9mm，n=16）和內(nèi)膜增厚組（max-IMT＞0.9mm，n=14），在內(nèi)膜增厚組LDL中，無(wú)論是9-HODE還是13-HODE水平均較正常組顯著升高

17、，P值分別為0.017和0.015。而血漿中9-HODE和13-HODE水平在內(nèi)膜增厚組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05)。對(duì)5-，12-，和15-HETE水平，無(wú)論是在血漿還是LDL中，在內(nèi)膜增厚組與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　LDL中HODE水平與mean-IMT的Spearman's相關(guān)分析提示，LDL中9-HODE和13-HODE水平均與mean-IMT呈顯著正相關(guān)（r值分別為0.47

18、9、0.447，P值分別為0.007、0.013），而HETE水平與mean-IMT不相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、亞臨床甲減患者隨著TSH水平的增加，出現(xiàn)了血脂、脂質(zhì)過(guò)氧化水平及動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的顯著增加，驗(yàn)證了亞臨床甲減、脂質(zhì)過(guò)氧化及動(dòng)脈粥樣硬化之間的密切聯(lián)系;
　　2、血LDL中的9-HODE和13-HODE水平是較HETEs及血漿中相關(guān)指標(biāo)在反映動(dòng)脈硬化程度上更敏感的指標(biāo);
　　3、本研究提示有必要對(duì)重