不同品種豬腸道微生物與體脂、ANGPTL4基因關(guān)系的研究.pdf

1、本研究以實時熒光定量TagMan-PCR和原代培養(yǎng)豬回腸上皮細胞技術(shù)，研究了不同品種豬腸道微生物與體脂、ANGPTL4基因的關(guān)系。研究包括六個試驗。 試驗一豬擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬16SrDNATagMan-PCR實時熒光定量PCR方法建立 通過對豬腸道30種細菌的16SrDNM序列進行比對分析，設(shè)計擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬熒光定量的特異引物；以多形擬桿菌菌株(CDCl404-A)基因組的DNA為模板，用常規(guī)PCR引物擴增

2、16SrDNA靶片斷，將PCR產(chǎn)物純化后作為DNA標準品，按1.19×10<'2>-1.19×10<'6>copies/ul 5個稀釋梯度的標準品作模板，建立定量標準曲線；用TaqMan探針建立25ul反應(yīng)體系，對不同濃度的多形擬桿菌DNA樣品進行檢測，檢測探針的敏感性；并以乳酸桿菌、大腸桿菌和雙歧桿菌的基因組DNA模板作陰性對照，檢測擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬的特異性。結(jié)果表明： 1)通過克隆測序，得到了擬桿菌屬一普雷沃氏菌屬細菌

3、的16SrDNA部分共有片段序列，該序列與Genbank中發(fā)表的多形擬桿菌(基因序列號為M58763)和中間普雷沃菌(基因序列號為AY323522)16SrDNA基因序列相比，該片段為多形擬桿菌的792～1003和中間普雷沃菌的763-974位堿基的片段，同源性分別為92％和94％。 2)25ul PCR反應(yīng)體系中Mg<'2+>的最佳工作濃度均為5.0mM，探針最佳工作濃度為.24μM，Taqman探針敏感性為3.73個/ul；

4、 3)本試驗所制作的標準品稀釋度在1.19×10<'2>-1.19×10<'6>copies/ul范圍線性關(guān)系良好，標準品可用于后續(xù)試驗的研究。 試驗二不同品種豬腸道微生物與體脂的關(guān)系試驗 通過選用在同一條件下飼養(yǎng)的0、1、2、3、4和5月齡的長白和太湖豬各4頭，屠宰取后回腸和盲腸內(nèi)容物，檢測1、3和5月齡長白和太湖豬回腸和盲腸內(nèi)容物的總細菌、革藍氏陽性細菌(Grampositivebacteria，G’)、革藍

5、氏陰性細菌(Gramnegativebacteria，G<'->)、革藍氏陽性細菌/革藍氏陰性細菌(G<'+>/G<'->)、擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬(Bacteroides-Prevotella，B.P)細菌數(shù)量、背膘厚度、脂肪率、脂肪細胞直徑和肌內(nèi)脂肪。結(jié)果表明： 1)太湖豬的回腸和盲腸內(nèi)容物的G<'->及B.P細菌數(shù)量在不同年齡階段均顯著(p(O.05)高于長白豬，G<'+>/G<'->極顯著低于(p(0.01)長白豬，總細

6、菌、G<'->與長白豬無顯著差異(p>O.05)。 2)豬回腸和盲腸的B.P和G<'->數(shù)量都與背膘厚度、脂肪率、脂肪細胞直徑和肌內(nèi)脂肪都有正相關(guān)關(guān)系，而G<'+>/G<'->比例與背膘厚度、脂肪率、脂肪細胞直徑和肌內(nèi)脂肪有負相關(guān)關(guān)系。 試驗三豬 ANGPTL4基因的克隆及其實時熒光定量TaqMan-PCR檢測方法的建立 為了對ANGPTL4基因進行更為準確定量，本研究首先克隆長白和太湖豬的ANGPTL4和β-a

7、ctin的DNA序列。根據(jù)所測定的序列，分別設(shè)計引物和探針，以回腸基因組的cDNA為模板，用常規(guī)PCR引物擴增，將PCR產(chǎn)物純化作為DNA標準品，ANGPTL4和β-actin基因標準品分別按1.37×10<'4>-1.37×10<'9>和8.31×10<'5>-8.31×10<'10>copies/mL的稀釋梯度建立定量標準曲線，以TaqMan探針建立25ul反應(yīng)體系，優(yōu)化探針的最佳工作濃度，并檢測探針的靈敏度。結(jié)果表明： 1

8、)應(yīng)用克隆測序方法獲得了長白和太湖豬的目的基因ANGPTL4和內(nèi)參基因β-actin的部分序列，所獲得的長白和太湖豬的ANGPTL4的片斷與參照序列(AY751522)的同源性分別為98％和92％，而β-actin與參照序列(U07786)的同源性都為98％。 2)ANGPTL4和β-actin探針在25ul體系中的最佳工作濃度分別為0.35州和0.40μM，探針的靈敏度分別為13.7和83.1拷貝/u1； 3)所構(gòu)建的

9、ANGPTL4和β-actin的標準曲線良好，反應(yīng)體系中分別含有1.37×10><'4>-1.37×10<'9>和8.31×10<'5>-8.31×10<'10>copies/mL時，擴增反應(yīng)ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，所得標準品可以用于后續(xù)試驗。 試驗四ANGPTL4基因在豬不同組織器官中的表達差異試驗 通過選用在同一條件下飼養(yǎng)的4月齡長白和太湖豬各4頭，屠宰后取肝臟、脂肪、心臟、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸。根據(jù)試驗三

10、克隆的長白和太湖豬的ANGPTL4基因的序列，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測~GPTI。4在不同品種組織中的表達差異。結(jié)果表明： 1)豬ANGPTI。4基因在肝臟、脂肪、心臟、小腸和大腸四種組織中都有表達，其中在脂肪組織的表達最豐富，其次是肝臟、大腸、心臟、小腸。 2)太湖豬的脂肪和肝臟組織ANGPTL4基因相對表達量都極顯著(p<0.01)高于長白豬，回腸和空腸中ANGPTL4基因表達量極顯著低于(p<0.01)長白豬

11、，盲腸、結(jié)腸、心臟中ANGPTL4基因表達量與長白豬無差異(p>0.05)。 試驗五不同品種豬回腸微生物與ANGPTL4基因的關(guān)系 選擇0日齡健康正常的太湖豬和長白豬各24頭進行150天的試驗。每個品種設(shè)為一個處理，每個處理按體重一致原則設(shè)4個重復(fù)，公母各半，每個重復(fù)6頭豬。在同一環(huán)境條件下飼予相同的飼糧，分別在0、1、2、3、4、5月齡，每種豬各屠宰4頭，測定回腸中ANGPTL4基因表達量和擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬細菌數(shù)

12、量。結(jié)果表明： 1)1-5月齡的太湖豬回腸擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬數(shù)量均高于長白豬，特別是在2、3和5月齡，極顯著(p<0.01)高于長白豬。兩品種豬的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬數(shù)量，都是隨著年齡增加，呈現(xiàn)先增加，2月齡下降，然后再上升的規(guī)律。 2)1-5月齡太湖豬回腸ANGPTL4基因表達量均低于長白豬，特別是在1、2和5月齡極顯著(p<0.01)低于長白豬，但在0日齡與長白豬的差異不顯著(p>0.05)：兩品種豬ANGPT

13、L4基因表達量與擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬的變化成相反趨勢，即先下降，后增加，再下降。 3)豬回腸擬桿菌、G<'->數(shù)量都與回腸ANGPTL4基因表達存在顯著(p<0.01)的負相關(guān)關(guān)系，而G<'+>/G<'->比例與回腸ANGPTL4基因表達存在極顯著(p<0.01)的正相關(guān)關(guān)系。 試驗六多形擬桿菌及代謝產(chǎn)物對豬回腸上皮細胞ANGPTL4表達的影響 本試驗以原代培養(yǎng)豬回腸上皮細胞為研究模型，研究了多形擬桿菌及其代謝

14、產(chǎn)物對豬回腸上皮細胞ANGPTL4表達的影響。試驗設(shè)7個處理，多形擬桿菌-1(10<'8>Cfu/ml)，多形擬桿菌-2(10<'7>Cfu/ml)、多形擬桿菌-3(10<'6>Cfu/ml)、代謝產(chǎn)物-1(10<'8>稀釋度)、代謝產(chǎn)物-2(10<'7>稀釋度)、代謝產(chǎn)物-3(10<'6>稀釋度)及對照組。10<'8>Cfu/ml多形擬桿菌和其相應(yīng)代謝產(chǎn)物組都設(shè)20個重復(fù)，其它處理組設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)1孔，在37℃培養(yǎng)96h后分別換

15、為含多形擬桿菌10<'8>、10<'4>、O<'6>Cfu/mlDMEM培養(yǎng)液和相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，分別于1、3、7、12和26小時收集10<'8>Cfu/m多形擬桿菌和其相應(yīng)代謝產(chǎn)物處理組的細胞，觀察隨濃度和作用細胞時間的變化，多形擬桿菌和其代謝產(chǎn)物影響ANGPTL4基因的表達情況。試驗結(jié)果表明： 1)多形擬桿菌與腸細胞數(shù)目為1:1時，即可抑制回腸ANGPTL4基因表達，這種抑制作用隨多形擬桿菌的濃度增加和作用時間延長越明顯。

16、 2)多形擬桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不影響ANGPTL4基因表達，但隨著時間的延長，ANGPTL4基因表達有提高的趨勢(p>0.05)。 綜合上面六個試驗，可得出如下結(jié)論： 1)太湖豬回腸和盲腸內(nèi)容物G<'->及B.P的數(shù)量高于長白豬，而G<'+>/G<'->低于長白豬，總細菌數(shù)及G<'+>與長白豬的差異不顯著；隨年齡的增加，總細菌數(shù)、G<'+>、G<'->的數(shù)量有增加的趨勢，G<'+>/G<'->有下降的趨勢，B.P的數(shù)