用于腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的熒光性核酸適體微流控傳感平臺(tái)研究.pdf

1、血液腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的最主要的疾病之一。發(fā)展針對(duì)血液癌癥早期診斷的方法，能夠有效地提高癌癥的治療率，因此這一直是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。其中，由于高靈敏性和高選擇性的特點(diǎn)，生物傳感器在疾病診斷、食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。而微型化、集成化、智能化的分析裝置，也是分析化學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)。近年來，許多新的生物技術(shù)、材料技術(shù)以及微加工技術(shù)的快速發(fā)展也促進(jìn)了生物傳感器的進(jìn)步。例如，基于SELEX

2、技術(shù)篩選的核酸適體不僅保留了傳統(tǒng)抗體的高特異性和高親和力，而且具有合成簡(jiǎn)便、小體積、穩(wěn)定性好、靶物質(zhì)范圍大、易于修飾、免疫原型小等特點(diǎn)。故以其作為新型的生物識(shí)別分子，為生物傳感器的設(shè)計(jì)提供了新的選擇。納米材料具有許多獨(dú)特的性能，如比表面積大、反應(yīng)活性位點(diǎn)多、催化效率高、吸附能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等，這些特點(diǎn)為生物檢測(cè)提供了新的手段，同時(shí)也推動(dòng)了化學(xué)和生物傳感器的迅速發(fā)展。微全分析系統(tǒng)具有樣品容量少、分析時(shí)間短、靈敏度高以及易于與其它技術(shù)聯(lián)用等

3、優(yōu)勢(shì)，這使它在對(duì)儀器檢測(cè)下限和分析動(dòng)態(tài)范圍有著嚴(yán)格要求的生物分析研究中占據(jù)越來越重要的地位。
　　針對(duì)光學(xué)生物傳感器在腫瘤的早期診斷過程中存在的問題，如癌變?cè)缙诩?xì)胞免疫表達(dá)腫瘤標(biāo)志物以及膜上過度表達(dá)的蛋白含量低、光學(xué)檢測(cè)背景干擾大、特異性不強(qiáng)、穩(wěn)定性差等，本論文結(jié)合納米材料、核酸適體以及微流控體系各自的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建了低背景、高穩(wěn)定性、高特異性的熒光生物微流控傳感平臺(tái)。其工作原理是:我們選擇單熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸適體作為識(shí)別體，氧化石墨

4、烯納米材料作為其吸附基質(zhì)和納米淬滅劑，依據(jù)他們之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用，構(gòu)建了熒光信號(hào)增強(qiáng)型核酸適體傳感器。論文的主要內(nèi)容如下:
　　第一章緒論
　　首先，介紹了血液腫瘤的研究背景和目前腫瘤診斷的常規(guī)方法。其次，系統(tǒng)闡述了核酸適體生物傳感器的原理、分類及其研究進(jìn)展，其中著重介紹了基于納米材料的FRET熒光型核酸適體傳感器。接著，闡述了微流控芯片在生物分析中的應(yīng)用，尤其是其與FRET技術(shù)的結(jié)合在生物檢測(cè)中的應(yīng)用。

5、最后，闡述了本論文的目的和意義。
　　第二章一種新型的氧化石墨烯納米探針技術(shù)應(yīng)用于快速、靈敏、混合核酸分子的熒光檢測(cè)
　　本文利用氧化石墨烯作為核酸分子的吸附平臺(tái)和熒光淬滅劑，以其作為納米探針發(fā)展了一種在均相溶液中快速、靈敏、特異性、多顏色的核酸分子的熒光檢測(cè)方法。首先，利用Hummers方法，在超聲輔助下，制備了單層結(jié)構(gòu)的、水溶性良好的氧化石墨烯納米材料。其次，通過CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了氧化石墨烯具有良好的生物相容性

6、。實(shí)驗(yàn)中，我們以氧化石墨烯作為納米探針，采取了“Postmixing”的策略，對(duì)多種核酸分子進(jìn)行了熒光檢測(cè)。該方法的基本原理是，先讓目標(biāo)DNA與熒光標(biāo)記的核酸適體發(fā)生雜交互補(bǔ)反應(yīng)，后向體系中加入氧化石墨烯，最后根據(jù)該體系熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行定量地分析。該方法對(duì)DNA1和DNA2的檢測(cè)范圍分別為15-100 nM和30-150 nM，檢測(cè)限分別為10nM和25 nM。這里，由于氧化石墨烯具有優(yōu)良的熒光淬滅性能，以及對(duì)單鏈DNA的特異性的識(shí)別

7、作用，使得檢測(cè)反應(yīng)能夠快速地（2 min內(nèi)）淬滅多種熒光基團(tuán)標(biāo)記的單鏈DNA，該方法的檢測(cè)時(shí)間明顯快于“Premixing”方法。同時(shí)，DNA雜交反應(yīng)的高度特異性保證了各個(gè)目標(biāo)之間的檢測(cè)互不干擾。因此，此方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)物快速、特異性的檢測(cè)，有望用于復(fù)雜體系的多物質(zhì)同時(shí)分析。
　　第三章基于氧化石墨烯的微流控?zé)晒鈧鞲衅脚_(tái)用于對(duì)腫瘤細(xì)胞的可視化、高通量檢測(cè)
　　本章結(jié)合核酸適體的高度特異性、氧化石墨烯納米材料優(yōu)良的淬滅性能、

8、以及微流控芯片少樣品、多通道的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建了基于FRET原理的、高靈敏的熒光信號(hào)增強(qiáng)型微流控傳感平臺(tái)，應(yīng)用于急性白血病腫瘤細(xì)胞CCRF-CEM的檢測(cè)。首先利用Hummers方法，在超聲輔助下，制備了單層結(jié)構(gòu)的、水溶性良好的氧化石墨烯。其次，選擇綠色熒光基團(tuán)FAM修飾的核酸適體Sgc8c，它能特異性識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞，并與氧化石墨烯通過π-π作用形成穩(wěn)定的FAM-Sgc8c/GO復(fù)合物。由于它們之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而可有效地降低背景的熒光

9、信號(hào)。當(dāng)引入目標(biāo)細(xì)胞時(shí)，核酸適體與目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得Sgc8c遠(yuǎn)離GO表面，從而使得被淬滅的熒光得到恢復(fù)。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)了具有33條通道的微芯片平臺(tái)，利用上述傳感原理，進(jìn)行可視化的、多細(xì)胞樣品的同時(shí)掃描成像分析。通過激光共聚焦掃描成像以及半定量分析得出，該微流控傳感芯片能夠同時(shí)對(duì)7種不同濃度的細(xì)胞樣品進(jìn)行定量分析，且細(xì)胞濃度在2.5×101-2.5×104 cells/mL范圍內(nèi)得到了良好的線性響應(yīng)，