AQP-4在缺氧缺糖后水腫星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用.pdf

1、目的：
　　 檢測水通道蛋白-4(aquapotin-4,AQP-4)在5h缺氧缺糖后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫形成及消退整個過程中表達(dá)變化的規(guī)律,分析其與缺氧缺糖引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫之間的關(guān)系,初步探討AQP-4在缺氧缺糖后水腫星形膠質(zhì)細(xì)胞中所發(fā)揮的作用。
　　 方法：
　　 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及缺氧缺糖水腫模型的建立:提取純化新生SD大鼠(新生2天內(nèi))大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞,并用神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFA

2、P)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定。將原代成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為正常組和缺氧缺糖組,缺氧缺糖組細(xì)胞經(jīng)過5h缺氧缺糖培養(yǎng)后恢復(fù)正常條件培養(yǎng)以建立缺氧缺糖模型,用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞在缺氧缺糖后0.5、2、8、24h和48h5個時間點(diǎn)的形態(tài)變化；
　　 2.AQP-4表達(dá)的檢測:選取5h缺氧缺糖后0.5、2、8、24h和48h5個時間點(diǎn),采用RT-PCR法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4 mRNA的表達(dá)變化；甩細(xì)胞免疫熒光染色法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞A

3、QP-4蛋白表達(dá)變化。比較星形膠質(zhì)細(xì)胞在5h缺氧缺糖后,其AQP-4的表達(dá)變化與細(xì)胞形態(tài)變化的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng),鑒定及缺氧缺糖水腫模型的建立:①光學(xué)顯微鏡下,原代成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞成片生長,呈多邊不規(guī)則形,有細(xì)長突起,細(xì)胞間連接緊密；②熒光顯微鏡下,GFAP細(xì)胞免疫熒光染色顯示,星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色呈陽性,細(xì)胞純度>98％；③光學(xué)顯微鏡下:5h缺氧缺糖后,星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹逐漸形

4、成并繼續(xù)加重,至2h時,腫脹達(dá)到高峰,此后腫脹逐漸消退,至48h時,細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常；
　　 2.AQP-4表達(dá)變化的檢測:①RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn):與正常組相比,缺氧缺糖組星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4 mRNA在5h缺氧缺糖后0.5h時表達(dá)先明顯下降(P<0.05),2h時有所回升(P>0.05),在8h時超過正常水平,并達(dá)到最高值(P<0.05),24h時有所下降(P<0.05),但仍明顯高于正常組水平,至48 h時表達(dá)基本恢

5、復(fù)正常水平(P>0.05)。②細(xì)胞免疫熒光染色法發(fā)現(xiàn):與正常組相比,缺氧缺糖組星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4蛋白在5h缺氧缺糖后的表達(dá)變化趨勢與其mRNA表達(dá)變化趨勢基本相同,在0.5h時表達(dá)先下降(P<0.05),此后逐漸回升,并在8h時超過正常水平并達(dá)到最高值(P<0.05),此后逐漸下降,至48h時基本恢復(fù)正常水平(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.5h缺氧缺糖模型能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯水腫,恢復(fù)正常條件培養(yǎng)后2h