糖酵解在Cdh1調(diào)控氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖中的作用及機制.pdf

1、研究背景及目的：
　　缺血性腦損傷是臨床上常見的疑難問題，常見的病因包括心臟驟停、中風(fēng)、圍術(shù)期多種因素引起的腦缺血等。它不僅是老年人致殘、致死的主要病因，近些年也嚴(yán)重危害著青少年的健康。明確腦缺血再灌注損傷的內(nèi)在機制對于治療缺血性腦損傷具有重要意義。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte，AS）是多功能的細(xì)胞，被認(rèn)為是大腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的基石，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。腦缺血后，AS發(fā)生活化，出現(xiàn)反應(yīng)性增殖。但AS的反應(yīng)性增殖

2、在腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)中的作用有利有弊。在缺血的初始階段，AS可保護正常腦組織細(xì)胞免受到毒性物質(zhì)的傷害，并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子為神經(jīng)元的再生提供底物。然而，在損傷的后期階段，活化的AS會導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕的形成，從而構(gòu)筑一個物理以及生化屏障阻礙軸突的再生，嚴(yán)重?fù)p害缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此明確缺血性腦損傷后AS發(fā)生反應(yīng)性增殖的內(nèi)在機制并及早抑制其增殖可以阻礙膠質(zhì)瘢痕的形成，可為神經(jīng)再生提供適宜的內(nèi)環(huán)境，最終加強缺血性腦損傷后的康復(fù)。
　　以

3、往研究顯示，在腫瘤細(xì)胞或是可增殖細(xì)胞中，細(xì)胞異常增殖伴隨著糖酵解途徑的激活。PFKFB3是糖酵解關(guān)鍵酶PFK1最有效的變構(gòu)激活劑，在快速增殖的細(xì)胞中PFKFB3有大量表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞核中，糖酵解被激活。但糖酵解與細(xì)胞增殖之間相互影響的具體機制尚不清楚。
　　真核細(xì)胞的增殖依賴于細(xì)胞周期末期促進復(fù)合物（Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome，APC/C）的活性。Cdh1為 APC/C的重要調(diào)節(jié)

4、分子，當(dāng)細(xì)胞處于在有絲分裂末期及G1期時，Cdh1與APC/C形成復(fù)合物，通過泛素化降解多種底物蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期的進程。近年新的研究表明，APC/C-Cdh1可識別PFKFB3所含的KEN box將其泛素化降解。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠全腦缺血模型中海馬組織中的Cdh1的活性下調(diào)，且離體氧糖剝奪再復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cdh1的含量降低。星形膠質(zhì)細(xì)胞在生理狀態(tài)下可表達(dá)高水平的PFKFB3，而APC/C-Cdh1活性較低。因此，我們進一步

5、推測，在腦缺血再灌注損傷這一病理過程中，APC/C-Cdh1可通過泛素化降解糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞中的糖酵解，進而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖。
　　氧糖剝奪再復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型是一種離體模擬缺血缺氧性腦損傷的實驗方法，已有研究證實，該方法可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖。因此本研究擬構(gòu)建離體大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R模型，

6、觀察氧糖剝奪對星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖酵解的影響，并通過構(gòu)建慢病毒或 siRNA特異性上調(diào)或下調(diào)糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)探究糖酵解變化與細(xì)胞增殖的內(nèi)在聯(lián)系；此外采用Cdh1過表達(dá)慢病毒或干擾慢病毒調(diào)節(jié)Cdh1的活性，探究Cdh1變化對OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解及增殖影響。
　　本實驗旨在觀察氧糖剝奪對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解的影響，以及糖酵解的變化是否參與并調(diào)控OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖，進而從糖酵解的角度，探討其在APC/C-C

7、dh1調(diào)控后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖的作用，為明確缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖的機制提供新思路。
　　研究方法及結(jié)果：
　　1.大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪再復(fù)氧模型的構(gòu)建及鑒定
　　方法：離體純化的成熟大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機分為對照組（Control）及氧糖剝奪再復(fù)氧組（OGD/R組）。OGD/R組加入無糖DMEM培養(yǎng)基，置入密閉缺氧小室內(nèi)，不斷通入混合氣體(含5％CO2，95%N2)，37℃培養(yǎng)3 h后更換為

8、標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，置于37℃三氣培養(yǎng)箱復(fù)氧24 h；對照組不進行缺氧處理。24h后細(xì)胞免疫熒光檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP與PCNA的表達(dá)，western blot檢測PCNA蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與Control組相比，OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)以及PCNA蛋白含量明顯增加（P<0.05），表明氧糖剝奪再復(fù)氧模型構(gòu)建成功。
　　2.OGD/R對星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶mRNA及蛋白表達(dá)水平的

9、影響
　　方法：體外純化的大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為對照組（Control）及氧糖剝奪再復(fù)氧組（OGD/R組）。OGD/R組氧糖剝奪3 h，復(fù)氧24 h。對照組不進行缺氧處理。結(jié)束后，分別提取細(xì)胞總mRNA及蛋白，采用RT-PCR及western blot檢測OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3及PFK1在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示，PFKFB3、PFK1與β-actin

10、產(chǎn)物的熔解曲線均具有特異性，與Control組相比，OGD/R后PFKFB3 mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05），而PFK1 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。western blot顯示，OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞中 PFKFB3與 PFK1蛋白表達(dá)與 Control組相比均明顯增加（P<0.05）。
　　3. PFK1過表達(dá)慢病毒干預(yù)對OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響
　　方法：將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為

11、四組：對照組，OGD/R組，OGD/R+PFK1-LV組和OGD/R+PFK1-CV組。慢病毒處理組加入PFK1過表達(dá)慢病毒或?qū)φ章《荆∕OI=10），感染3天后，進行OGD/R處理。采用EdU、western blot檢測不同處理干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：EdU檢測顯示，與OGD/R+PFK1-CV組相比，PFK1過表達(dá)慢病毒組EdU陽性率明顯增加（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示，與PFK1-

12、CV組相比，PFK1過表達(dá)慢病毒組PCNA蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。
　　4.PFKFB3 siRNA可抑制OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖
　　方法：將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為四組：對照組，OGD/R組，OGD/R+PFKFB3 siRNA組（OGD/R+siPFKFB3組）和OGD/R+陰性對照siRNA組（OGD/R+NC siRNA組）。siRNA干預(yù)組加入PFKFB3 siRNA或?qū)φ誷iRNA，轉(zhuǎn)染3

13、天后，進行OGD/R處理。采用EdU、western blot檢測不同處理干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：EdU檢測顯示，與OGD/R+NC siRNA組相比，OGD/R+siPFKFB3組EdU陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05）；western blot檢測顯示，與OGD/R+NC siRNA組相比，OGD/R+siPFKFB3組PCNA蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。
　　5.PFKFB3 siRNA可

14、抑制OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞中糖酵解的激活
　　方法：將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為四組：對照組，OGD/R組，OGD/R+siPFKFB3組和OGD/R+NC siRNA組。siRNA干預(yù)組加入PFKFB3 siRNA或?qū)φ誷iRNA，轉(zhuǎn)染3天后，進行OGD/R處理。收集培養(yǎng)基和提蛋白。采用western blot檢測不同處理組糖酵解關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)變化，分光光度計檢測各組培養(yǎng)基中乳酸含量。
　　結(jié)果：Western bl

15、ot顯示，與OGD/R+NC siRNA組相比，OGD/R+siPFKFB3組PFKFB3與PFK1蛋白表達(dá)減少（P<0.05）；分光光度計檢測各組培養(yǎng)基中乳酸含量結(jié)果顯示：與OGD/R+NC siRNA組相比，OGD/R+siPFKFB3組乳酸釋放明顯受到抑制（P<0.05）
　　6. Cdh1過表達(dá)慢病毒干預(yù)對OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解的影響
　　方法：將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為四組：對照組，OGD/R組，OGD

16、/R+Cdh1過表達(dá)慢病毒組（OGD/R+Cdh1-LV組）和OGD/R+對照慢病毒組（OGD/R+Cdh1-CV組）。慢病毒處理組慢病毒感染3天后，進行OGD/R處理。收集培養(yǎng)基和提蛋白。采用western blot檢測不同處理組糖酵解關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)變化，分光光度計檢測各組培養(yǎng)基中乳酸含量變化。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示，與OGD/R+Cdh1-CV相比，Cdh1過表達(dá)慢病毒組中星形膠質(zhì)細(xì)胞Cdh1明顯增加（

17、P<0.05），PFKFB3、PFK-1蛋白表達(dá)下降（P<0.05）；分光光度計檢測各組培養(yǎng)基中乳酸含量結(jié)果顯示：與對照病毒組相比，Cdh1過表達(dá)慢病毒組乳酸釋放明顯受到抑制（P<0.05）。
　　7. Cdh1干擾慢病毒對星形膠質(zhì)細(xì)胞感染效率的確定
　　方法：采用Cdh1干擾慢病毒及對照慢病毒，分別以MOI為1、5、10和20感染星形膠質(zhì)細(xì)胞，感染72 h后，在倒置熒光顯微鏡下，觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，確定最佳MOI

18、。將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為Control組，Cdh1干擾慢病毒組（siCdh1-LV組）和對照慢病毒組（siCdh1-CV組），以最佳MOI感染星形膠質(zhì)細(xì)胞，提蛋白，western blot檢測Cdh1干擾慢病毒干預(yù)對Cdh1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：熒光結(jié)果顯示，MOI為1、5、10、20感染星形膠質(zhì)細(xì)胞均能觀察到GFP表達(dá)。當(dāng)MOI=10時即可達(dá)到較好轉(zhuǎn)染效果，從經(jīng)濟角度，選擇MOI為10進行后續(xù)實驗。Western b

19、lot顯示：與Control組和siCdh1-CV組相比，Cdh1干擾慢病毒組Cdh1的表達(dá)明顯下降（P<0.05）。
　　8. Cdh1干擾慢病毒干預(yù)對OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞中PFKFB3表達(dá)的影響
　　方法：將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機分為四組：對照組，OGD/R組，OGD/R+Cdh1干擾慢病毒組（OGD/R+siCdh1-LV組）和OGD/R+對照慢病毒組（OGD/R+siCdh1-CV組）。慢病毒處理組慢病毒感染3

20、天后，進行OGD/R處理。提蛋白，采用western blot檢測不同處理組糖酵解關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：Western blot檢測結(jié)果顯示，與siCdh1對照慢病毒組相比，Cdh1干擾慢病毒組中星形膠質(zhì)細(xì)胞PFKFB3蛋白表達(dá)進一步增加（P<0.05）。
　　9. Cdh1干擾慢病毒干預(yù)與siPFKFB3單獨或聯(lián)合干預(yù)對OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞中PFKFB3表達(dá)及增殖的影響
　　方法：將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)

21、胞隨機分為五組：Control組，OGD/R組，OGD/R+siCdh1-LV+siPFKFB3組，OGD/R+siCdh1-LV+NC siRNA組和OGD/R+siCdh1-CV+siPFKFB3組）。慢病毒與siRNA聯(lián)合干預(yù)組，慢病毒感染8 h后，加入siRNA，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，進行OGD/R處理。提蛋白，采用western blot檢測不同處理組糖酵解關(guān)鍵酶及PCNA的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：Western blot顯

22、示，與對照慢病毒組相比，Cdh1干擾慢病毒組中星形膠質(zhì)細(xì)胞PFKFB3與PCNA蛋白的表達(dá)進一步上調(diào)（P<0.05），采用PFKFB3 siRNA聯(lián)合干預(yù)，可逆轉(zhuǎn)Cdh1干擾慢病毒干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞PFKFB3與PCNA蛋白的表達(dá)（P<0.05）
　　10.統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有

23、統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究總結(jié)
　　一、主要研究結(jié)果
　　1.離體實驗發(fā)現(xiàn)，糖酵解關(guān)鍵酶PFK1及PFKFB3蛋白高表達(dá)于大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，且主要定位于細(xì)胞核中。氧糖剝奪再復(fù)氧處理可上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中PFK1及PFKFB3的表達(dá)及細(xì)胞的糖酵解能力。
　　2.離體實驗證實，PFK1過表達(dá)慢病毒上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中PFK1蛋白的表達(dá)，可增強細(xì)胞糖酵解，進而加劇OGD/R后細(xì)胞的反應(yīng)性增殖；反之，采用siRNA下調(diào)PFK

24、FB3蛋白可降低細(xì)胞糖酵解，從而抑制細(xì)胞的反應(yīng)性增殖。
　　3.離體實驗證實，Cdh1過表達(dá)慢病毒可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中PFKFB3、PFK1的表達(dá)及乳酸的釋放，進而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖；反之，Cdh1干擾慢病毒加劇OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞中PFKFB3表達(dá)的增加，聯(lián)合使用PFKFB3 siRNA干預(yù)，可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。
　　二、研究結(jié)論:
　　氧糖剝奪再復(fù)氧可明顯增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3及PFK1的表達(dá)且