Syndecan-1與炎癥性腸病發(fā)病機制關系的初步探討.pdf

1、研究背景與目的： 炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是一種病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎性病變，包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's Disease，CD），是胃腸道最為嚴重的疾病之一。該病常突發(fā)起病，多數(shù)病程緩慢，有反復發(fā)作的傾向，少數(shù)病例呈急性暴發(fā)，病情兇險，病程較長者亦被認為結腸癌的癌前病變，世界衛(wèi)生組織將其列為難治性疾病之一。該

2、病在我國發(fā)病率比較低，但近年來有大幅增加的趨勢。目前認為IBD的發(fā)病機制為：環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌叢的參與下，啟動了腸道免疫及非免疫系統(tǒng)，最終導致免疫反應和炎癥過程。但是始終未找到一種特定微生物和IBD恒定相關。 Syndecans是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，包含有硫酸乙酰肝素（HS）及硫酸軟骨素鏈修飾的Ⅰ型跨膜核心蛋白。硫酸乙酰肝素鏈能與許多對血管修復、血管發(fā)生及免疫細胞生長及細胞-細胞、細胞-細胞外基質間黏附起調節(jié)

3、作用的配體如許多生長因子、細胞因子、趨化因子和細胞外基質等相互作用。Syndecans主要包括四個成員，其中Syndecan-1（CD138）是上皮細胞包括血管內皮細胞的主要Syndecans成員。Syndecan-1攜帶的HS側鏈可結合一系列配體如細胞粘附分子、細胞外基質成份、生長因子及細胞因子等，以共受體方式調節(jié)細胞與細胞、細胞與微環(huán)境之間的相互作用，參與細胞粘附、組織分化、血管形成及宿主防御等諸多生理病理過程的調節(jié)。 關于

4、Syndecan-1和腫瘤關系研究比較多，但是在炎癥方面卻是近幾年才開始受到重視，國內罕見報道。Syndecan-1胞外段可在脫落酶（sheddase）作用下從細胞表面水解脫落形成可溶性效應分子并被吸收入血。Syndecan-1的胞外段HS鏈，是其主要功能部位，能與炎癥過程中的眾多的粘附分子、細胞外基質成分、細胞因子、趨化因子等結合，在炎細胞的滾動、貼壁、黏附、游出等步驟中發(fā)揮作用，因此可認為，Syndecan-1與炎癥過程關系密切。在

5、Syndecan-1基因敲除（Sdc1-/-）小鼠中，生長及發(fā)育均無異常。但是在綠膿桿菌的攻擊下，Sdc1-/-小鼠明顯耐受感染，表現(xiàn)出顯著下降的細菌定植力及明顯減輕的肺部炎癥和死亡率，說明Syndecan-1促進了感染性炎癥的發(fā)生。Syndecan-1還參與細胞-細胞外基質的粘附。介導細胞粘附到胞外基質蛋白的主要受體為整臺素家族受體，但胞外基質蛋白還具有結合糖胺聚糖的能力，尤其是硫酸乙酰肝素。細胞能利用整合素和Syndecan-1雙受

6、體來介導細胞-細胞外基質的粘附。 而在炎癥的研究中，國外就肺炎與Syndecan-1的關系研究較多。在肺炎中，已證實MMP-7可導致Syndecan-1的脫落，形成的可溶性Syndecan-1與中性粒細胞趨化因子KC結合，動員KC形成趨化梯度，吸引中性粒細胞，促進肺炎的發(fā)生。但是關于Syndecan-1和腸炎之間的關系罕有報道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Syndecan-1在IBD模型小鼠腸上皮細胞表面的表達明顯減低，而血清中游離Sy

7、ndecan-1明顯增加，提示IBD與Syndecan-1脫落增加相關。有研究提示Syndecan-1表達缺失或破壞時可造成腸上皮屏障功能受損，導致蛋白丟失，分泌性腹瀉及營養(yǎng)障礙等，而在IBD患者的再生粘膜中也存在Syndecan-1的表達缺失，從而影響?zhàn)つさ挠?。另外，Syndecan-1似乎也和各種細胞因子有相互作用。Day RM等證實促炎因子TNF-α，IL-1β對腸上皮細胞中Syndecan-1的表達起下調作用，可能機制為通過使

8、Syndecan-1的外功能區(qū)的脫落增加而引起腸道的炎癥反應。 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細胞壁主要成分，也稱為內毒素，在感染和炎癥中起著至關重要的作用。鑒于Syndecan-1與炎癥及感染關系密切，而腸道非特異性炎癥亦和感染有重要關系?；谝陨媳尘?，我們推測，腸道細菌可能通過影響Syndecan-1的表達來參與腸道非特異性炎癥的過程。因此我們通過與細菌感染密切相關的促炎因素TNF-α和L

9、PS刺激腸上皮細胞，觀察不同劑量刺激物對Syndecan-1表達的影響，為Syndecan-1在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供重要線索，研究內容包括： 1、Syndecan-1在不同疾病患者腸粘膜組織及不同腸上皮細胞系中的表達; 2、不同劑量TNF-α刺激下Syndecan-1在腸上皮細胞的表達變化; 3、不同劑量LPS作用下腸上皮細胞及細胞培養(yǎng)上清中Syndecan-1的變化; 4、不同劑量LPS刺激下腸

10、上皮細胞粘附力的改變; 方法: 1、免疫組化法檢測IBD、結腸腺瘤及結腸腺癌患者腸粘膜組織中Syndecan-1的表達。 2、流式細胞儀分析不同腸上皮細胞株，篩選出Syndecan-1表達量高的SW480細胞用于后續(xù)實驗。 3、免疫熒光染色法檢測不同劑量TNF-α刺激SW480細胞后，Syndecan-1表達變化。 4、免疫熒光染色法檢測不同劑量LPS作用SW480后Syndecan-1表達變化。

11、 5、Dot-blot檢測各組細胞和培養(yǎng)上清Syndecan-1蛋白水平的變化。 6、細胞計數(shù)法檢測不同組粘附力改變。 7、統(tǒng)計學處理：采用SPSS13．0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以x±S表示，進行單向方差分析；Dot-blot結果進行多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗；P<0．05認為差異有統(tǒng)計學意義。 結果: 1、Syndecan-1在腸粘膜組織中的表達：在不同疾病腸粘膜組織中，Syndecan-1表達

12、有明顯差異。在IBD患者腸粘膜組織中，上皮細胞表面表達減少，間質表達增多，血清中游離Syndecan-1水平明顯升高。而在低分化腺癌中，Syndecan-1表達呈缺失狀態(tài)。 2、Syndecan-1在不同腸上皮細胞的表達：SW480細胞高表達Syndecan-1分子，HT-29細胞表達少量Syndecan-1分子，Lovo細胞基本不表達Syndecan-1分子。 3、不同濃度TNF-α作用下SW480細胞表達Syndec

13、an-1的趨勢變化：隨著TNF-α濃度增加，Syendecan-1的表達熒光強度由強漸弱。TNF-α對Syndecan-1表達呈劑量依賴性。各組間F=73．498，P＝0．000，差異有顯著性意義。進一步做多重比較對照組（0ng/ml組）和2．5ng/ml組的差別無統(tǒng)計學意義，（P=1．000），而其他的各組間差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P=0．000）。 4、不同濃度LPS作用下SW480表達Syndecan-1的趨勢變化：在未加

14、LPS組（即0ng/ml組），可見Syndecan-1膜表達明顯，隨著濃度增加，熒光減弱，到104ng/ml組，熒光幾乎不能檢測，可見LPS對Syndecan-1表達的影響呈劑量依賴性。各組間F=106．300，P=0．000，差異有顯著性意義。進一步做多重比較103ng/ml組和104ng/ml組的差別無統(tǒng)計學意義，（P=0．066），而其他的各組間差異均有顯著統(tǒng)計學意義。0ng/ml組vs10ng/ml組，P=0．003；0ng/m

15、l組vs其他組，P=0．000。 5、不同濃度LPS作用下腸上皮細胞Syndecan-1脫落的變化：隨LPS濃度增加，細胞培養(yǎng)上清中Syndecan-1蛋白呈逐漸增多趨勢，處理組IOD比值高于對照組，各組間差異有顯著性意義，X2=12．321，v=4，P=0．015。104ng/ml組上清中蛋白表達量最高，103ng/ml組和102ng/ml組次之。 6、不同濃度LPS作用后腸上皮細胞同質粘附力改變：隨著LPS劑量的遞增

16、，細胞與細胞之間粘附力下降。各組間F=264．364，P=0．000，差異有顯著性意義，進一步做多重比較。對照組（即未加LPS組）和10ng/ml組的差別無統(tǒng)計學意義，（P=0．984），而與其他的各組差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P=0．000） 結論: 1、在IBD患者的腸粘膜組織中，Syndecan-1蛋白在膜表達較正常減低，而間質表達增多，血清中游離Syndecan-1較正常對照組明顯增多，表明Syndecan-1脫落

17、增加與IBD發(fā)生相關。 2、促炎因子TNF-α和細菌內毒素LPS對腸上皮細胞Syndecan-1表達呈劑量依賴性，隨著TNF-α和LPS濃度增高，腸上皮細胞表面Syndecan-1表達減少，而腸上皮細胞培養(yǎng)上清中游離Syndecan-1逐漸增加，說明細菌感染和促炎因子可促進Syndecan-1的脫落。 3、LPS刺激后，腸上皮細胞粘附力亦隨之下降，并呈劑量依賴性。 4、腸道細菌和炎癥因子可能通過增強Syndeca